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3'UTRの数塩基が変わるだけでGFPの発現は変わるか？ トピック削除
No.5874-TOPIC - 2017/04/01 (土) 12:17:53 - GFP3
普通のGFP発現ベクターのターミネーター配列を変える実験を行っており、まず、ベクターのGFP下流に元々入っていたターミネーター配列をsitedirected mutagenesis (SDM) で欠失させました。

このベクターを用いてHeLa細胞に対してトランスフェクションを行ったら、当然といいますかGFPは蛍光顕微鏡で見られなくなったんですが、別のターミネーターを入れるためにSDMで入れておいた制限酵素サイトが、うっかりミスによりGFP遺伝子の下流〜元ターミネーター配列があった部位の上流（＝MCS的な部位です）に存在していることが発覚し、MCSのその制限酵素サイトの前後2つの制限酵素で切断し、平滑化し、セルフライゲーションさせることで、問題の制限酵素サイトを潰しました。

そして無事に新しい別のターミネーターを入れることに成功したのですが、たまたま新しいターミネーターを入れる前、すなわちSDM後に、余計な制限酵素サイトを潰した後のベクターを用いてトランスフェクションを行ってみたら、なんと、GFPの発現が、蛍光顕微鏡で確認されました（非常に強い活性、ターミネーター欠失前と同程度）。

回りくどく説明下手で恐縮ですが、SDM後のベクター（GFP発現なし）と、制限酵素欠失後のベクター（GFP発現あり）には、用いた2つの制限酵素サイト約10塩基程度のありなしの違いしかありません（シークエンスで確認済み）。

なぜ後者のベクターで突然GFPの発現が復帰したのか不思議極まりないのですが、何か見落としがちな基本事項がありますでしょうか？もし何かありましたら、アドバイスいただけると大変ありがたいです。
　
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(無題) 削除/引用
No.5874-4 - 2017/04/01 (土) 21:29:07 - GFP3
monさん、おおさん、回答ありがとうございます。

あ、記述がやはり悪かったですね。特に隠すわけでもないのですが、ターミネーターはpolyAシグナルを含む、よく用いられているものです（ベクターマップで○○ terminatorと表記されているエレメント）。

なるほど、やはり何らかのpolyAシグナルが露出してきた、と考えるのが普通でしょうか。ただ、10塩基程度を「削ったら」活性が上がったということで、そんなことはあり得るのかなと思ったのですが、おおさんのおっしゃる通り、削って出来たものがたまたまATリッチだった、という可能性がありますね。実際、まぁ、削る前よりはATリッチになってるかな、という気がします。

こんな掲示板に質問を丸投げしておいて『興味深い発見をした』も何もない気もしますが、とりあえずhandling errorではないことから確かめていこうと思います。

示唆に富むご指摘、どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.5874-3 - 2017/04/01 (土) 14:41:50 - おお
AT richな配列ができちゃってPoly Aシグナルとして認識されちゃったかなとおもったりしたけど。。。

(無題) 削除/引用
No.5874-2 - 2017/04/01 (土) 14:11:23 - mon
「ターミネーター配列」は転写終結シグナルですか？それともpolyA付加部位を含めた領域ですか？　大腸菌とは異なり、ほ乳類細胞の「転写終結シグナル」のコンセンサス配列は明確ではないので、「ターミネーター配列」とは言わないと思っていましたが。。
ほ乳類の場合、GT-richな配列でRNA polymeraseが一時的な停止している間にpolyA付加が起こり、その後明確な位置でなく転写終結が起こる、またGT-richな配列がないpolyA付加部位（領域）を有する遺伝子もある、また、AATAAA上流の(mRNA上の）配列が下流の配列と協調的に作用してpolyA付加効率を高めるという報告もあったと記憶していますが、最近の知見と合っているかな？
なので、その約10bpという配列がAATAAA上流の配列と相互作用するのかも。
興味深い現象を発見したのかもしれませんね。

3'UTRの数塩基が変わるだけでGFPの発現は変わるか？ 削除/引用
No.5874-1 - 2017/04/01 (土) 12:17:53 - GFP3
普通のGFP発現ベクターのターミネーター配列を変える実験を行っており、まず、ベクターのGFP下流に元々入っていたターミネーター配列をsitedirected mutagenesis (SDM) で欠失させました。

このベクターを用いてHeLa細胞に対してトランスフェクションを行ったら、当然といいますかGFPは蛍光顕微鏡で見られなくなったんですが、別のターミネーターを入れるためにSDMで入れておいた制限酵素サイトが、うっかりミスによりGFP遺伝子の下流〜元ターミネーター配列があった部位の上流（＝MCS的な部位です）に存在していることが発覚し、MCSのその制限酵素サイトの前後2つの制限酵素で切断し、平滑化し、セルフライゲーションさせることで、問題の制限酵素サイトを潰しました。

そして無事に新しい別のターミネーターを入れることに成功したのですが、たまたま新しいターミネーターを入れる前、すなわちSDM後に、余計な制限酵素サイトを潰した後のベクターを用いてトランスフェクションを行ってみたら、なんと、GFPの発現が、蛍光顕微鏡で確認されました（非常に強い活性、ターミネーター欠失前と同程度）。

回りくどく説明下手で恐縮ですが、SDM後のベクター（GFP発現なし）と、制限酵素欠失後のベクター（GFP発現あり）には、用いた2つの制限酵素サイト約10塩基程度のありなしの違いしかありません（シークエンスで確認済み）。

なぜ後者のベクターで突然GFPの発現が復帰したのか不思議極まりないのですが、何か見落としがちな基本事項がありますでしょうか？もし何かありましたら、アドバイスいただけると大変ありがたいです。
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