Bio Technical フォーラム

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APFによるhROS測定 トピック削除
No.5870-TOPIC - 2017/03/31 (金) 00:18:17 - ひで205
こちらのフォーラムではいつも勉強させていただいております。

APFをインディケーターとして、いわゆるhighly ROSを測定しようと試みています。
ストック溶液は5mM in DMSOで調製し、測定前にPBSで100uMに希釈、これを終濃度10uMになるよう
サンプルに加えて室温で反応させたのち、490/525nmで測定していますが、同アッセイ系がワークしている方に
お伺いしたいことがあり、トピックを作成させて頂きました。
このアッセイを行う前の私のイメージでは、反応液を調製する段階では液色はほぼ無色であり、
刺激を加えると蛍光色を呈すると想像していましたが、実際に実験を行ってみたところ、
ストック溶液をPBSで希釈した段階ですでに液色が黄緑色に変化し、それでも構わず実験を進めましたが、
想定外の結果が出てしまいました。その原因を考えてみたところ、APFストックを希釈した際、
液色がすでに濃い黄緑色を呈していたことに思い当たったのですが、希釈したAPF溶液は黄緑色を呈するもの
なのでしょうか？ご経験のある方にアドバイスを頂けたら非常に助かります。
　
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(無題) 解決済み 削除/引用
No.5870-5 - 2017/04/02 (日) 23:32:47 - ひで205
moz様、

レスポンス頂きありがとうございます。
今回私が実験に使用したAPFについてですが、DMSOでは無く、DMFに溶解しておりました。確認不足で申し訳御座いません。

その後、自己解決に近づきつつありますので、ご報告させて頂きます。国内でAPFを取り扱っている五稜化薬のwebサイトにてAPFのインストラクションを確認したところ、以下のような記述がありました。「試薬はバッファー等に希釈すると黄色い色の溶液になりますが、この状態では蛍光はほとんど観察されません。」よって、試薬の劣化によりフレッシュなものに比べて呈色強度が上がっている可能性はありますが、少なくともストック溶液をバッファーに希釈すると、実験の際に私が見た黄緑色に近い駅色を呈するようです。同ストック溶液を使い、実験条件を変えて試してみたいと思います。

おお様、moz様、レスポンスを頂戴し有り難うございました。

(無題) 削除/引用
No.5870-4 - 2017/04/01 (土) 14:03:45 - moz
AFPを扱ったことはないので思いつきですが。
DMSO中の不純物でAFPの分解が進んでいると言うことはないでしょうか。
DMFに溶解させた方が良かったのでは。。

(無題) 削除/引用
No.5870-3 - 2017/04/01 (土) 00:49:50 - ひで205
おお様、

レスポンス頂きありがとうございます。
仰るとおり呈色強度＝蛍光強度ではありませんが、呈色により蛍光強度の測定に影響が出る可能性はあるかと思います。

私の実験では、非常に弱い刺激でROSを誘導する予定です。よってノイズを最大限下げ、一方、シグナルを増加させて感度を上げたいのです。一度アッセイを行って見たところ、シグナルに対してノイズ（ブランク）が非常に高く、反応液が呈色していることが、この高いノイズの原因となっているのでは無いかと考えたわけです。APFの保存状態が悪かったことや、私自身、APFを使ったROSアッセイを行ったことがありませんので、APFストックを測定用バッファーで希釈した際、無色であったストック溶液が濃い黄緑色を呈することが一般的であるのかどうか、それの点が私の質問の本質になります。引き続き、ご教授頂けましたら幸いです。


>[Re:2] おおさんは書きました :
> 色（吸収）と蛍光はちょっと違うと思うのですけど、、、溶液でそのままとROSで反応させたもので蛍光測ってみたら大体察しがつくと思いますが。

(無題) 削除/引用
No.5870-2 - 2017/03/31 (金) 08:30:01 - おお
色（吸収）と蛍光はちょっと違うと思うのですけど、、、溶液でそのままとROSで反応させたもので蛍光測ってみたら大体察しがつくと思いますが。

APFによるhROS測定 削除/引用
No.5870-1 - 2017/03/31 (金) 00:18:17 - ひで205
こちらのフォーラムではいつも勉強させていただいております。

APFをインディケーターとして、いわゆるhighly ROSを測定しようと試みています。
ストック溶液は5mM in DMSOで調製し、測定前にPBSで100uMに希釈、これを終濃度10uMになるよう
サンプルに加えて室温で反応させたのち、490/525nmで測定していますが、同アッセイ系がワークしている方に
お伺いしたいことがあり、トピックを作成させて頂きました。
このアッセイを行う前の私のイメージでは、反応液を調製する段階では液色はほぼ無色であり、
刺激を加えると蛍光色を呈すると想像していましたが、実際に実験を行ってみたところ、
ストック溶液をPBSで希釈した段階ですでに液色が黄緑色に変化し、それでも構わず実験を進めましたが、
想定外の結果が出てしまいました。その原因を考えてみたところ、APFストックを希釈した際、
液色がすでに濃い黄緑色を呈していたことに思い当たったのですが、希釈したAPF溶液は黄緑色を呈するもの
なのでしょうか？ご経験のある方にアドバイスを頂けたら非常に助かります。
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