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(無題) 削除/引用 No.586-8 - 2012/05/31 (木) 15:29:06 - qq >CSTのデータシートに書かれていた通り、Blockingは5％BSA, washには1xTBSTを用いて行いました。 blockingのあと、一次抗体も、blocking液で溶解しましたよね。 リン酸化ペプチド抗体だから、BSAに結合して抗体を作成している可能性が少なくありません。分子量的にアヤシイですね。BSAペプチド抗体であれば、BSA抗体を中和する意味で1次抗体液にBSAを入れておくことが有効です。 BSAを１レーン流して、ウェスタンすると、大当たりだったりして。

(無題) 削除/引用 No.586-7 - 2012/05/30 (水) 12:42:42 - NE JNKをノックダウンさせてみて、そのバンドが消えるようなら、JNKのバリアントの可能性もあるかと思います。 手間はかかるかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.586-6 - 2012/05/30 (水) 12:02:07 - どん子 ab様、TS様、コメントを頂きありがとうございます。 先程CSTのテクニカルに同じ旨のメールを送りました。 返答が届き次第、こちらにまたアップさせて頂きます。 私自身、経験が浅いため結果の解釈に悩んでおりましたが、 経験のある方からのコメントを頂き、そういうこともあるのだと分かり、 とほっとしました。

(無題) 削除/引用 No.586-5 - 2012/05/30 (水) 08:30:59 - TS WBでは目的バンドよりも強い特異的（?）なバンドが出ることも まぁまぁある思います。 わたしは目的バンドが出ている限り、基本的には気にしませんが、 リン酸化、トータルの両方の一次抗体で出ているところが気になりますね。 両方ともCSTから購入されておりますし、 有益な情報が得られるかわかりませんが、 CSTのテクニカルにもさらっと聞いてみたらどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.586-4 - 2012/05/30 (水) 08:24:34 - ab > GAPDH（こちらもCSTのもので、rabbitです。）で、 > 同じサンプルについてWBしましたが、その時には目的のバンドのみ検出できました。 それならば、二次抗体の非特異的な影響の可能性は低いみたいですね。 > S-S結合が還元できていない場合は、2-meを再度加えてボイルし直すことで > 解消される可能性はあるのでしょうか？ 自分で書いておいてなんですが、還元処理をしているのであれば普通は還元されていないバンドは出たとしても相当薄いので、メインのバンドが大量にある場合にうっすら見えるくらいです。 もし、メインのバンドと同じ位出るのであれば、関係ないです。 抗体の認識性は抗体によって結構バラバラで、非特異的なバンドがでることはよくあります。悪いときは、非特異的なバンドばかりでる抗体もあります。 特定のサンプルのみでもう1本バンドが出るという事は、そのサンプルの何かをたまたま非特異的に認識しているということで、それほど気にする必要はないと思います。 どうしても何か確認したいのであれば、免疫沈降してSDS-PAGE後に質量分析とかでしょうか。 そこまで労力をかける必要もないですよ。

(無題) 削除/引用 No.586-3 - 2012/05/30 (水) 02:46:44 - どん子 アドバイスありがとうございます。 GAPDH（こちらもCSTのもので、rabbitです。）で、 同じサンプルについてWBしましたが、その時には目的のバンドのみ検出できました。 S-S結合が還元できていない場合は、2-meを再度加えてボイルし直すことで 解消される可能性はあるのでしょうか？ もし解消される可能性があるならば、まだサンプルは取ってあるので、 新しいサンプルを準備するまでの間にもう一度やってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.586-2 - 2012/05/30 (水) 02:06:23 - ab 二次抗体だけでも出ますか？ そのサンプルを用いて、他のラビットの一次抗体を使っても出ますか？ もし出るなら、抗体の非特異的な相互作用によるものでしょう。 タンパク質が分解して高い位置にバンドがでることはまずないですが、S−S結合が還元できなければ出る事もありえます(JNKの場合はわかりませんが）。

p-JNK, JNKのＷＢでバンドが三本現れます 削除/引用 No.586-1 - 2012/05/29 (火) 23:54:07 - どん子 いつも参考にさせて頂いております。 現在p-JNKとJNKについて、WBを行っています。 用いた抗体は SAPK/JNK antibody CST,#9252 p-SAPK/JNK antibody CST,#9251です。 CSTのデータシートに書かれていた通り、 Blockingは5％BSA, washには1xTBSTを用いて行いました。 データシートでは、54kDa, 46kDaにバンドが検出されると書かれており、 論文等を調べてもそのようなデータが多いのですが、 なぜか65-70kDa付近にもう一本しっかりとしたバンドが検出されます。 他のサンプルではこの高さにバンドは検出されず、 ある細胞の特定の分画でのみ（初代細胞）このようなバンドが出ました。 初代細胞でかつ、論文等でも報告があるものではなく、 判断に苦しんでおります。 このバンドはリン酸化、非リン酸化抗体どちらでも検出されます。 いろいろ調べてみてもはっきりせず、相談させて頂きました。 サンプルの扱いに問題があったのか？と心配になり、 現在別のサンプルを回収して、もう一度やり直してみようと思っております。 ちなみにタンパクの分解で目的よりも高い位置にバンドが出ることはあるのでしょうか？（低い位置なら納得が行くのですが・・・） 教えて頂けると助かります。 よろしくお願いいたします。

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