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(無題) 削除/引用 No.5844-11 - 2017/03/22 (水) 10:03:54 - AA みなさんpx458をよく使われているのですね。 ピューロマイシン選択のpx459は余り採用されていないのでしょうか？ (FACSのほうがシングルクローン化が容易だからでしょうか？)

(無題) 削除/引用 No.5844-10 - 2017/03/22 (水) 00:24:57 - ウイルス double nickaseを用いていくつかKO細胞を樹立しました。 nickaseのため多少異なるかもしれません。参考程度にお願い致します。 私の場合に常に2セット（nickaseなのでKOに2か所のguideRNAが必要）を用意し、これまでのところ少なくとも一方がワークしております。効率は10−20クローン取って約半数がKOされていましたが、これはターゲットにもよります。ラボのほかのメンバーは30-50クローン取って完全なKOは1個ということもありました。 また、私も当初GFP陽性細胞（transfection後2-3日後）をisolationしてましたが、細胞株によっては（おそらく）その時点でゲノム編集が完了しておらず？、樹立したKO細胞が2種類以上のヘテロな集団だったことがあります。（サブクローニングして少なくとも2種類の細胞が混在していることを確認しました。） 今は、GFP陽性細胞をソートした後にsingle isolationしてwesternで発現チェック、その後にゲノムのチェックをしています。または、single isolation後、westernで発現が確認できないものをsubcloningしています。 また、長く継代されている細胞株ではアリルが2つとは限りませんので、少し注意が必要かもしれません

(無題) 削除/引用 No.5844-9 - 2017/03/19 (日) 15:16:05 - 編集者 >[Re:7] おおさんは書きました : > 知り合いは開始コドンあたりと、もう一つバックアップで一箇所選んでいました。両方からクローンは取れましたので、とりあえず開始コドンあたりを壊したものを使ってます。少なくとも２つ作っておけば両方を発現させて間を飛ばすこともできますよね。 おお様 ご返信ありがとうございます。 やはり最低2つくらいは試した方が良さそうですね。 今開始コドン付近で一つ作っているので、機能ドメインなどもターゲット候補として検討してみることにします。

(無題) 削除/引用 No.5844-8 - 2017/03/19 (日) 15:11:52 - 編集者 ものくろ様 ご返信ありがとうございます。 バックボーンは同じくpx458を使用する予定です。恥ずかしながらいきなりGFPでシングルセルソートを行おうとしていましたが、確かにバルクで先に各ガイドの活性を見ておけばその後の作業を軽量化できますね！ またsgRNAによってはかなり効率がよいものもあるとのことで、やはり数種試してみることにします。 一先ずご教示いただいた手順にて進めてみようと思います。有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.5844-7 - 2017/03/18 (土) 14:59:18 - おお 知り合いは開始コドンあたりと、もう一つバックアップで一箇所選んでいました。両方からクローンは取れましたので、とりあえず開始コドンあたりを壊したものを使ってます。少なくとも２つ作っておけば両方を発現させて間を飛ばすこともできますよね。

(無題) 削除/引用 No.5844-6 - 2017/03/18 (土) 14:51:55 - ものくろ ごめんなさい。誤って投稿してしまいました。 プラスミドのバックボーンは何ですか？ 私はFeng Zhang博士のpX458です。 トランスフェクトされたものはgfp陽性になるので、まずどのガイドが良いかを判断するため、gfpポジをバルクソートして、そこからゲノムを取って編集効率をガイド間で比較してみてはいかがですか？ まったく効果のないガイドだと、バルクのゲノムはきれいに編集はありませんが、いいものだと、pam配列上流に編集の跡が見られますよ。 こういった予備検討でどのガイドが良いか決めたのちに、改めてトランスフェクトしてgfpポジをバルクではなく、シングルソートして、クローンをタイピングすればいいと思います。 中にはホモだと致死になる遺伝子もあるので一概には言えませんが、ホモばかりとれるガイドも過去にありました。

(無題) 削除/引用 No.5844-5 - 2017/03/18 (土) 14:45:59 - ものくろ >[Re:4] 編集者さんは書きました : > AA様、ものくろ様 > ご返信有難うございます。実際にご経験されている方々からのご教示、大変有り難く存じます。 > やはりsgRNAごとの活性のばらつきは結構あるのですね。 > プラスミドトランスフェクションにて行うつもりなので、クローンの選定作業も考慮して手の回る範疇で複数のsgRNAを試してみようと思います。 > > また重ねての質問となってしまい大変恐れ入りますが、、 > ご経験からほとんどワークしないsgRNAがあるという印象を受けたのですが、逆に「うまくワークした」という場合で大体どのくらいの確率でヘテロあるいはホモのKOクローンが得られているか、ご教示いただけますと幸いです。 > 選定作業を行うクローン数の参考にしたく存じます。

ご返信有難うございます 削除/引用 No.5844-4 - 2017/03/18 (土) 14:14:00 - 編集者 AA様、ものくろ様 ご返信有難うございます。実際にご経験されている方々からのご教示、大変有り難く存じます。 やはりsgRNAごとの活性のばらつきは結構あるのですね。 プラスミドトランスフェクションにて行うつもりなので、クローンの選定作業も考慮して手の回る範疇で複数のsgRNAを試してみようと思います。 また重ねての質問となってしまい大変恐れ入りますが、、 ご経験からほとんどワークしないsgRNAがあるという印象を受けたのですが、逆に「うまくワークした」という場合で大体どのくらいの確率でヘテロあるいはホモのKOクローンが得られているか、ご教示いただけますと幸いです。 選定作業を行うクローン数の参考にしたく存じます。

(無題) 削除/引用 No.5844-3 - 2017/03/18 (土) 04:02:09 - ものくろ 効率だけでなく、オフターゲット効果などもありますので、いくつか試した方が安全ですよね。 私はこれまで3つほどのノックアウトを作ってきましたが、いずれも最低2つガイドを作って試していますが、効率はガイドによって全然違います。今思えば2つのうち1つがこれまで3つの樹立においてワークしていてよかったと胸を撫で下ろしています。

(無題) 削除/引用 No.5844-2 - 2017/03/17 (金) 17:50:50 - AA ガイド配列によって活性は全然違いますね。 普段は3−4箇所くらい試しますが、プラスミドのトランスフェクションなら もっとたくさん試すこともできると思います。

CRISPR-Cas9によるKO：sgRNAを何通り試していますか 削除/引用 No.5844-1 - 2017/03/16 (木) 20:42:38 - 編集者 お世話になります。 ラボでCRISPR-Cas9によるゲノム編集の実験系を立ち上げようとしております。 タイトル通り、sgRNAを何通り試すか悩んでおります。 目的は株化培養細胞でのある遺伝子のKOです。2013のnature protocolで報告されている原法に則って1つのsgRNAを用いてNHEJによるフレームシフトを考えております。 ターゲットサイトは開始コドンの下流近傍を想定しております。 皆様は経験的に何通りのsgRNAを試されていますでしょうか。 またsgRNAによって変異導入の効率などが結構違ったとか、そういった経験はありますでしょうか。 ご教示いただけますと幸いです。

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