全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5843-14 - 2017/03/29 (水) 22:37:46 - picotaro 大変遅くなりましたが、本日wild mouseを用い、retroorbitalで採血して、a2b3aで染めて、FSC,SSCのボルテージをそれぞれ450程度に高くしてやってみたところ、CaCl2ありではやはり出ず、CaCl2なしでは血小板の分画が得られました！今回もヘパリン入りTBSを用いました。 血小板測定用のビーズ（直径5.5μm）がグラフから（SSC軸で上に）はみ出してしまったのが玉に傷ですが。 この論文のプロトコルを書いた人は本当にこの実験やったんですかね……？ でも皆様のおかげで小さくて大きな一歩が踏み出せました！ 今後活性化の実験などもやってみたいと思います。 このスレッドで血小板ご専門の方々に非常にプラクティカルな点について教えて頂き、また関連した質問も投げかけて頂きありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5843-13 - 2017/03/29 (水) 10:06:11 - u >ものくろ様 私もやる前は組織因子やコラーゲンで 血小板が活性化するのではと思っていました。 回数は多くやっていないので確実なことは言えませんが 下大静脈採血と尾採血でCD62Pを比較しましたが どちらも発現は認められませんでした。 尾採血の場合、個体によって血液が出にくいものがいて 時間がかかると活性化してしまうとは思います。 ですので私の場合は、パラフィルムにEDTA/PBSorを10uLドロップしておいて 尾の先端5mm程度を完全に切断し、先端をドロップに付けて 採血するようにしています。切断面にEDTAが作用するので 凝固系が動かないのかもしれません。推測の域を出ませんが・・・

(無題) 削除/引用 No.5843-12 - 2017/03/29 (水) 08:56:30 - aso 心臓、眼窩静脈、尾静脈から採血してCD62Pを比べてみたことがあります。特に差は無かったので、速やかに抗凝固処理出来ればどこから採っても良いのかな、と思っています。チークブリーディングとは比較したことはありませんが。

(無題) 削除/引用 No.5843-11 - 2017/03/29 (水) 08:24:30 - ものくろ ＞尾静脈から全血20ul取れば 横からすみません。 この方法では組織因子によってすでに活性化してしまっていそうですが、CD62Pの発現は見られていますか？ 後学のために教えていただけますと幸いです。私はもっぱらチークブリーディングで数マイクロとれればそのままフローにかけています。

(無題) 削除/引用 No.5843-10 - 2017/03/29 (水) 00:57:00 - u 追記です。 希釈した血液を150g程度で３分くらい室温遠心して 赤血球白血球を沈殿させると上清に血小板が残ります。 それを別のチューブに取って蛍光灯にかざしながら緩やかにタッピングすると 血小板が沢山含まれていれば、もやもやキラキラ見えるはずです。 薄めの大腸菌の菌液のもやもや感に似ています。 ただ血液量が少ない（希釈倍率が高すぎる）と見えにくいです。 血液50ulを適切なbuffer150ulで希釈した場合の遠心後 の上清なら 血小板が活性化していなければ確実にもやもや見えますので 採血方法が大丈夫か試してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5843-9 - 2017/03/28 (火) 23:24:43 - u 血小板研究してるものです。 採血のときのバッファーがまずい気がします。 私はTBSは使ったことがないのでTBSがＯＫなのかはわかりません。 問題は抗凝固剤としてheparinを使っている点です。 heparinは抗凝固作用はありますが、基本的に抗血小板作用はありません。 また、tyrodeにCaCl2が入っているのも気になります。 Caは凝固も進めるし血小板も活性化しやすくしてしまうので 血小板の凝集実験をする際はCa-free tyrodeを使います。 検出したい抗原がintegrinのようなCaがないと構造が変化してしまうものの 場合は別ですが、そうでなければEDTAを使うといいと思います。 EDTAはCaのキレートによって凝固も血小板活性化も強力に抑制します。 私の場合は5mM EDTA in PBS 180ulに尾静脈から全血20ul取れば フローサイトなら十分以上の血小板が取れます。 EDTAがダメならfinal 10%チトラートで取ります。 チトラートもCaをキレートしますが、 EDTAよりはマイルドなのでCaが必要な抗原にも使えます。

picotaro 削除/引用 No.5843-8 - 2017/03/20 (月) 14:26:25 - picotaro Googleに落ちていた個人的に作られたPDFファイルに「0.5 μm~25 μm程度まで解析可能」とあったのですが、確かにマイクロパーティクルの分析の論文もよく見ます。血小板ごときで音を上げていてはいけないですね。チークブリーディングで１μl取るときは、ピペットでprewetしたチップを用いて吸われていますか？その後ビーズと混ぜるときはピペッティングしないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5843-7 - 2017/03/20 (月) 01:46:33 - ものくろ 血小板よりもはるかに小さいマイクロパーティクルなどもフロー解析しますので、マウス血小板が検出限界付近ということはまずないと思います。感度の設定を適切にすれば、十分解析可能です。血小板由来マイクロパーティクルだと、ノイズとの区別に苦労しますが血小板は問題にはなりません。 私はマウス血小板を解析していますが、チークブリーディングで1マイクロ採取したのち、決められた濃度の定量用ビーズとまぜ、フロー解析しています。

(無題) 削除/引用 No.5843-6 - 2017/03/19 (日) 20:41:37 - picotaro なるほど！確かに、一度目視してみます。大きさは人間の血小板が1-2μm、マウスは0.5μmなので、FACSの検出限界の小ささということになりますね。 参考文献は「Flow-cytometric analysis of mouse platelet function. Methods Mol Biol. 2004;272:255-68m Nieswandt B1, Schulte V, Bergmeier W.」なのですが、そこにはNote3として、「細胞外Cαは血小板活性化におけるインテグリンの親和性制御やその他のプロセスに必要である。結果的には、低値のCαは全血や血小板の保存中の活性化を防ぐか遅延させる。」したがって実験の直前に加えるべき旨記載されております。 アイスは使いませんでした。 ゲートはなるほど、抗体で染めておいてゲートバックすることができるんですね！ 今回は全血を用いた血小板数の測定です。顔面の静脈を用いる方法は私もYoutubeで調べていいな、と思いました。しかし今回はチューブに垂らす方法だと精確に50μl測り取ることができず、どこかで一回はピペットで測り取る必要が生じます。また溶液も混ぜないといけません。以前の質問のやりとりでご指導いただいたように、尻尾からヘパリンで濡らしたチップでピペットを用いて吸ってみたのですが、50なかなか吸えず、retroorbitalでやってみたりもしました。（いずれも血小板は出てきませんでした。） Tyrone's bufferは「Tyrode’s buffer (modified): 134 mM NaCl, 0.34 mM Na2HPO4, 2.9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, pH 7.0, 5 mM glucose, 0.35% (w/v) bovine serum albumin.」と、グルコース入りです！それがきっとmodifiedの意味なんですね。 とりあえず、定量的なことは置いておいて、まず抗体で染めた状態で機器設定、特にボルテージのチェックをすればよさそうでしょうか。 それで血小板が出て来れば、血小板数の測定や活性化の解析など細かいことを考えられますね。

(無題) 削除/引用 No.5843-5 - 2017/03/17 (金) 04:16:58 - ものくろ 血小板のラボにいます。 マウスの血液はどこから採取していますか？ もっとも侵襲性の低い方法で採取しないと血小板はすぐに活性化します。 チークブリーディングが最適だと思います。その際に最初の一滴目は捨てること、グルコース入りタイロードバッファーを用いることをしています。氷冷厳禁、ピペッティング厳禁ですね。 活性化しているかどうかに関してはCD62P染色でいいでしょう。 ゲートに関してですが、血小板の未染色、CD41で染色したものを用意し、CD41ポジにゲートをして、それをFSCーSSCにゲートバックすればどこに血小板がいるか確認できるでしょう。あとはFSC、SSCのボルテージを適当なものにして、赤血球とマイクロパーティクルの間に血小板がくるように私は調整しています。

(無題) 削除/引用 No.5843-4 - 2017/03/17 (金) 03:39:54 - aso とりあえず血液を顕微鏡で見て凝集塊があるか確認してはいかがでしょうか。ある程度サンプルの状態を評価できるでしょう。 マウス血液を使える血算計を持っているラボが運良くあれば一度使わせてもらうのも良いでしょう。 サンプル調製の点ではbufferにカルシウムが入っているのが凝集の原因になりうると思います。私はCa-free Tyrode’s bufferを使っています。 また、一般的なFACSと同じようにon iceで染めていると凝集します。 FACSに関しては、ema様もおっしゃられるように血小板のポピュレーションを見つけるまで苦労する事があります。できれば熟練者と一緒に動かすのが一番ですね。

(無題) 削除/引用 No.5843-3 - 2017/03/16 (木) 20:27:59 - picotaro 先輩と手探りですが、血小板をやったことのある人間は皆無です……。今回ボルテージがどうだったかわからないので聞いてみます。添付していただいた文献の図1の血小板のpopulationすら出てこなかった状態です。。。ありがとうございます。

機器のレンジは？ 削除/引用 No.5843-2 - 2017/03/16 (木) 20:14:31 - ema FACSのマシンコントロールは自分で手さぐりですか、それとも先輩ややったことのある技術スタッフとやっていますか？ 血小板の領域は小さいので、血球系に慣れている人で分画がうまくわからないというような事がありました。 FSC、SSCのVoltageなどを血球よりもあげる必要性があり、２台あれば１台は小さな分画まで、もう１台は大きな（普通の）分画で早くソートとセッティング仕分けることもあります。 https://www.bdj.co.jp/pdf/66-010-01.pdf

マウス血小板のFACS：消えた血小板 削除/引用 No.5843-1 - 2017/03/16 (木) 19:52:55 - picotaro 5698「マウス全血、精確な量をチューブに移したい」で相談させていただいた者です。その節はありがとうございました。実際にFACSをやってみたところ、FSC/SSCのグラフにそもそも血小板が現れませんでした。赤血球は現れました。プロトコルは 50 µl whole blood + 200 µl TBS/heparin (20 units/ml) + Tyrode's buffer (cont. 0.138 mg/ml CaCl2) --> 50 µl of the diluted blood + (antibody etc) + 1 ml assay diluent Assay diluentは1%FBS入りのD-PBSを使いました。 何がいけなかったのでしょう？ 血小板が凝集してしまったのでしょうか？ 抗体などなしにしてとりあえずワイルドタイプマウス１匹でやっても出なかったのです。 ぜひ経験のある先生教えてください。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---