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(無題) 削除/引用 No.5811-7 - 2017/03/07 (火) 01:35:26 - おく 3-6様、ありがとうございます。 > 現象Yは阻害剤X-タンパクXが作用したとき特異的に起こる事象ですか？ > 阻害剤X⇔タンパクXの特異性ももちろんですが、現象Y⇔タンパクXの特異性はどうでしょうか 現象Yはその阻害剤特有のものではありません。 ですが、確かにおっしゃっていただいたように、ノックアウトの方がわずかに現象Yの強度がWTに比べ低い気がします。 ですが、みなさまからのご意見を聞かせていただいて、293Tなどの細胞でもターゲテイングに使われているのだと知り、安心しました。

(無題) 削除/引用 No.5811-6 - 2017/03/07 (火) 01:33:06 - おく 中年様、おお様、mon様ありがとうございます。 パラログの可能性は考えておりませんでした。勉強になります。 Ensemble Genome Browserによると、alternative spliced variantsがいくつかありますが、ターゲティングに使用したサイトはすべてで保存されており、安全と考えていました。 ＞完全な活性のKOができてない場合もあります。 これをどう証明するかが困難だと思ってしまいますが、みなさんは完全なノックアウトと断言するのはどういう方法を用いておられますでしょうか？ ＞KOの細胞は何クローン取りましたか？ とったクローンは2つです。採るのに難渋しました。増殖も極めて遅く、刺激にも弱いです。（レンチでレッスキューすると元に戻ることは確認済みです）漸くとれた2つで表現型は一致しています。 ＞Xの直接の下流などもう少し詳しく見れませんでしょうか？ はい。Xの下流はWTの細胞に比べて動いていないようです。ただ、薬剤処理などチャレンジの条件下ではXの下流がしっかり動いています。もしかしたらノックアウトではないのか、、というのがめちゃくちゃ不安です。。 ノックアウトだという証明として、たとえばゲノムPCRをやってターゲティングした領域を増やしてクローニングしたのち、ここのPCRアンプリコンを読んで行くことで、20個中、すべてでフレームシフトを持つシークエンスであることを確認すればノックアウト、、、、と言えるのかとか、そういうことを考えています。。 パラログの可能性は論文を検索する分に関しては見つかりませんでした。

(無題) 削除/引用 No.5811-5 - 2017/03/06 (月) 18:04:45 - 3-6 現象Yは阻害剤X-タンパクXが作用したとき特異的に起こる事象ですか？ 阻害剤X⇔タンパクXの特異性ももちろんですが、現象Y⇔タンパクXの特異性はどうでしょうか なんらかのコントロールを取りながら実験を行っているのではないかと思いますが、 コントロールと比べると、現象Yの有無や強度の違いはいかがですか？

(無題) 削除/引用 No.5811-4 - 2017/03/06 (月) 13:56:26 - mon HeLaにはHPVの遺伝子も挿入されているので、その影響かも。。

(無題) 削除/引用 No.5811-3 - 2017/03/06 (月) 10:31:48 - おお 通常のノックアウトでも問題になることがあるのだけど、スプライシングや別のプロモーターからできたパーシャルなターゲットの配列をもつ物が微量ながらも発現することによって完全な活性のKOができてない場合もあります。 KOの細胞は何クローン取りましたか？取ったクローンですべて同じ結果ですか？こちらのラボではHEKでたまにやりますが、数クローン取ることにしてます。たまに特異的抗体でもしかしたら気がつかないくらいのレベルでいつものところと違う場所にバンドが出るクローンがあったりして、その細胞ではKOの作用が完全でなかったりという経験はあります。 その他Xのパラログの可能性、阻害剤が何か別の作用を持つ可能性など色々あると思います。Xの直接の下流などもう少し詳しく見れませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5811-2 - 2017/03/06 (月) 09:40:43 - 中年 Ｘにパラログが存在して、個体だと組織特異的に発現しているはずのものが、HeLaだと両方発現してしまっているという可能性はありませんか。

タンパク質X阻害剤のXノックアウト細胞に与える影響について 削除/引用 No.5811-1 - 2017/03/06 (月) 09:28:22 - おく お世話になります。 CRISPR-Cas9 systemを利用して、遺伝子Xのノックアウト細胞をHeLa細胞ベースに作製しました。 Xはヒト14番染色体に乗っている遺伝子です。HeLaを使用したのは、これまでのデータはこの細胞で示してきており、この細胞でXのノックアウト細胞を作りたかったという理由がありました。 早速ご意見を聞かせていただきたいのですが、Xの機能阻害剤（競合阻害剤）が市販されております。 シグマより購入しまして、これまでのデータから野生型のHeLaに阻害剤を作用させると、Yという現象が現れることは確信しています。 Xのノックアウトマウスも作成し、in vivoでYという現象が確認されてました。 そこでここにきて、XのノックアウトHeLaを作成し、阻害剤Xを作用させてみたところ、予想では（阻害剤がX特異的だとの前提であれば）Yという現象は現れないだろうと思っていたのですが、予想に反してYが確認されてしまいました。二度繰り返したので間違い無いようです。 この解釈としては、樹立したXノックアウトHeLa細胞が、ノックアウトではなかった。か、X阻害剤がタンパク質Xにだけ特異的ではないという可能性が挙げられると思います。 みなさまにお聞きしたいのは、HeLa細胞などガンのセルラインでCRISPR-Cas9 systemでノックアウトを作る時の注意点としてどのようなものがありますか？私はqPCRやウエスタンで目的の遺伝子X、タンパク質Xが消えていることは確認していますし、ゲノムを読み、フレームシフトが起きていることは確認しています。 HeLa細胞ではなく、ハプロ細胞ベースで作るべき、などそういうご意見はあるかもしれませんが、今回どうしてもHeLa細胞で行いたかったのですが、考えが及ばなかったということもあるのかと思い、みなさまにお聞きしました。ご意見聞かせていただけると幸いに存じます。よろしくおねがいいたします。

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