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(無題) 削除/引用 No.5805-10 - 2017/03/06 (月) 10:35:23 - げげ Trackerさんの示している試薬のメーカーである、サーモフィッシャーのサポートに電話して確認しました。 結論ですが、Trackerさんの示している試薬では目的を達成できないということになりました。また、他には方法は無いということです。 ただ、 RTPCRをする際にはイントロンをはさんだプライマー設計にする、 qPCRをする際にはTaqmanアッセイにしてイントロンをはさんだプライマー設計でプローブもエクソン上にする、 という対策があるということでした。

(無題) 削除/引用 No.5805-9 - 2017/03/06 (月) 10:22:50 - げげ 皆様、御意見や情報をありがとうございました。 なお、Trackerさんの示している試薬のFAQに次がありました： Q: Does dsDNase cleave ssDNA? A: No, dsDNase cleaves only double-stranded DNA. However, if ssDNA forms double-stranded structures, it will act as a target for dsDNase. Because of this, long and complex ssDNA may be partially degraded. Therefore we recommend additional dsDNase inactivation step for RT-PCR amplification of targets 3 kb or longer. The inactivation step should be performed by 5 min incubation at 55 degrees C in the presence of 10 mM DTT.

(無題) 削除/引用 No.5805-8 - 2017/03/04 (土) 09:14:29 - おお いい方法論が樹立されていれば、普及してそうな感じがするのですが、、、検証してみないと働いているのやら見極めきれないような気がします。 制限酵素も各種DNA・RNA２本鎖でどの程度働くのかなど酵素によってはまちまち色々あるかもしれません。調べてないのでデーターがないようであれば使ってみるのは冒険だし。 RNaseH処理後にというのであればわからなくもないけど、完全に解けているのかとかいろいろな心配もあるわけで。 Trackerさんの示している試薬はオリジナルに系を確立しなくていいのでとっつきやすそうです。部分的なcDNAの２本鎖はゲノムほどアニールしている部分が長くないのである程度温度を上げてほどいてやることはできそうな気がします。

(無題) 削除/引用 No.5805-7 - 2017/03/03 (金) 21:55:12 - ふみ ゲノムからPCRがかかってしまう領域に制限酵素があればPCRのバッファ中で制限酵素処理したらどうでしょうか。 十分に制限酵素処理できたかどうかは、ゲノム中でその制限酵素の配列の中でcDNAにないものをPCRで増やしてみたら分かると思います。あるいは、泳動で分かるならそれでも確認できますよね。

(無題) 削除/引用 No.5805-6 - 2017/03/03 (金) 21:12:34 - Tracker www.thermofisher.com/order/catalog/product/EN0771 一応あるみたいですが、1本鎖DNAの中で部分2本鎖を形成しているような所は切れないのだろうか。

(無題) 削除/引用 No.5805-5 - 2017/03/03 (金) 21:02:59 - 774R >DnpIは違いましょう？ メチル化されたGATC配列、つまりdamメチル化された配列を切るんであって。 確かに。 真核生物でもアデニンの6Nメチル化は起こることが知られてるけど、ズタズタに分解するにはメチル化効率が高くないかもしれないですね。 4塩基認識制限酵素カクテルでもいいし、「二本鎖特異的ヌクレアーゼ」というのも市販されてるみたいなのでどうでしょう？

(無題) 削除/引用 No.5805-4 - 2017/03/03 (金) 19:54:55 - AP そんな便利な酵素があったら大儲けだ。 DnpIは違いましょう？ メチル化されたGATC配列、つまりdamメチル化された配列を切るんであって。 理屈からいうと制限酵素なら何でもいい。切断配列の頻度の高い4塩基認識の制限酵素でどうでしょう。

追記 削除/引用 No.5805-3 - 2017/03/03 (金) 19:27:58 - 774R DpnIはPCRの過程で失活するし、仮に活性が残存したとしてもPCR産物は切断しないので適してるかも。

(無題) 削除/引用 No.5805-2 - 2017/03/03 (金) 19:25:35 - 774R >二本差DNAのみを分解し、一本差DNAは分解しないような酵素 ぱっと思いつくのはDpnI

cDNA溶液中のゲノムDNA除去する方法 削除/引用 No.5805-1 - 2017/03/03 (金) 19:22:14 - げげ よろしく御願いします。 共同研究者から分与されたcDNA溶液を泳動した結果、ゲノムDNA のコンタミがみつかりました。PCRに使うと、ゲノムDNA由来の サイズの増幅産物が増えます。 訳あって、新たに調整することができないため、このcDNA溶液中 のゲノムDNAを除去して、RTPCRやqPCRに用いたいのです。 何かよい方法は無いでしょうか？ 二本差DNAのみを分解し、一本差DNAは分解しないような酵素で、 反応後の液をそのままRTPCRやqPCRに用いられうようなものなどが あれば有り難いです。

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