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(無題) 削除/引用 No.5800-4 - 2017/03/03 (金) 08:56:12 - mon >発現させているエラスターゼはプロ酵素なので、 切断されたmatureなformを発現させてはダメな理由があるのでしょうか。切断されていてもサブユニット構造（ヘテロ2量体）となっているとか。

(無題) 削除/引用 No.5800-3 - 2017/03/03 (金) 02:59:10 - 乙 確かに(過剰)発現している? WBしてみた？ 変異その他で正しい高次構造にならずに、活性がないということはない？ lysis bufferは活性を発揮するうえで適切？ 細胞にカビのコンタミはない？ という点はOK?

(無題) 削除/引用 No.5800-2 - 2017/03/03 (金) 00:44:35 - おお そのエステラーゼの遺伝子名や由来がわからないのと、どの細胞に入れたかも情報がないのに正確な回答がつくんだろうかと思いますが、トリプシンを使うと活性化どころか必要なところも切れてしまってずたずたになりそうな気がします。トリプシン処理をせずに一度やってみてはどうでしょうか。活性化型とプリカーサーはSDSPAGEとかで見分けれないでしょうか。 またそのエステラーゼが発現していることをどのようにして確認しているのでしょうか。Endogenousのエステラーゼ活性はあなたのアッセイ系で無視できるのでしょうか。

エラスターゼの活性化 削除/引用 No.5800-1 - 2017/03/02 (木) 21:06:04 - こうぞう 細胞にエラスターゼを過剰発現させ、そのライセートを用いて蛍光基質にて活性測定を行いたいのですが全く上手く行きません。 構築した実験系において、精製品のエラスターゼを用いた場合はきれいに活性測定できます。 発現させているエラスターゼはプロ酵素なので、トリプシンによる活性化が必要と考え、消化ステップを入れているのですが切れているのかどうなのかイマイチ分かりません。 古い文献を調べると、エラスターゼの活性化には50mM程度のトリスでも可能とあり、必ずしもトリプシン消化を必要としないのでしょうか？ ちなみにトリプシンによる消化は以下の条件で行っております。 100mM Tris-HCl pH8.0, 2mM CaCl2 30min-O/N at37℃ 何か良いアドバイスをいただけると助かります。 よろしくお願いいたします。

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