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(無題) 削除/引用 No.5794-15 - 2017/03/01 (水) 14:29:24 - KT しにたいさん、具体的には名前を公開することはできません。申し訳ありません。シングルトランスフェクションです。タンパク質分解は細胞外基質のタンパクのため可能性が低いです。 774さん、おっしゃる通りです。ただ、細胞外基質のタンパクのため、大腸菌 or in vitroでタンパクを作ってポジコンとするしかないかもしれません。検討してみます。 774Rさん、同じ遺伝子で間違いありません。ヒトとマウスで78%、挙動（切断や分解）が異なることがあるということですね。全くバンドがないということで、もう一度maxiprepしたもののコンストラクトを見直します。 おおさん、エピトープが修飾されている可能性については考えませんでした。Stop codonを除いてTagをC末端につけて発現実験をしてみたいと思います。 あと抗体ですが、マウスは認識しないヒト用の抗体がありました。一度試してみたいと思います。 これでこれからやらないといけないことが分かりましたので、いったん終了とさせて戴きます。みなさん、コメントありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5794-14 - 2017/03/01 (水) 14:08:36 - おお 細胞の選択は相性と割り切って違う細胞を適当に使うてることもあるでしょう。またあなたの蛋白を分泌しているであろう組織由来の細胞（タイプ）であれば、ネガティブなレギュレーションはま逃れることができる可能性がいくらかでもあるのではないかと、あとはHEK293Tという細胞はCOS7と同様にプラスミドを複製する能力がありますので強い発現が期待できるみたいです。 抗体はそれ一種類しかないのですか？

(無題) 削除/引用 No.5794-13 - 2017/03/01 (水) 13:48:23 - おお 特に分泌される蛋白なら、マウスは糖鎖が付いているがヒトはついていないとかもあるので、そういうところにエピトープが来てないかなという懸念はありますが、、、 Tagは機能という面では確かに懸念があるんですが、発現するシステムかどうかの評価としては白黒つきやすいので、、、

(無題) 削除/引用 No.5794-12 - 2017/03/01 (水) 10:58:24 - 774R >ヒトとマウスでアミノ酸のhomology は78% アミノ酸配列で78%だと同じ遺伝子ではないような印象を受けますが、アイソフォームということはないでしょうか？ 配列でそれだけ違うと違う挙動（切断や分解）をしても不思議はないように思います。 また、マウス由来タンパク質だと強烈に反応する抗体であれば、ヒトのタンパク質の発現効率が相当落ちたとしても少しは反応が見られそうなものですが、それがないということは、私ならコンストラクトを疑います。 過去にPCRを介さない制限酵素サイトでのクローニングで、クローニングサイトとは関係のない部分に一塩基欠損が起きた経験があり、同じ工程で作り直したら上手くいったことがあります。（大腸菌でもまれに変異を起こすことがあるようです。） シーケンスをもう一度確認するか、作り直すというのも手だと思います。 「HEK以外の細胞で」というのは特に明確な根拠があって書いたわけではありませんが、簡単にやれるならもしかしたら上手くいくかもしれないし、やっぱりダメなら細胞と遺伝子の相性以外を疑う理由くらいにはなると思います。

(無題) 削除/引用 No.5794-11 - 2017/03/01 (水) 10:31:51 - 774 自分だったら、抗体がちゃんとヒトのタンパクに対して機能するのかを確認するかな。 分泌されるのでタグはたしかに避けたいとこですね。 ヒトで確実に発現してる細胞の培養上清、大腸菌 or in vitroで作ったタンパクを使ってWB。

(無題) 削除/引用 No.5794-10 - 2017/03/01 (水) 10:00:05 - しにたい 具体的にタンパク質名を示されるともう少しアドバイスができるかもですが、難しそうですかね。 なにかコトランスフェクションされていますか？あるいはタンパク質分解を疑って、MG132やクロロキンを試されていかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5794-9 - 2017/03/01 (水) 09:51:58 - KT おおさん、コメントありがとうございます。 Tagは入れていないです。実験系に影響が出そうなためです。 HEK293でエンドでは検出できないです。ただ同じ遺伝子のマウスcDNAを導入すると強力に発現しますので、positive controlはworkしていると思います。 ヒトとマウスでアミノ酸のhomology は78%で、抗体のエピトープ部位は同じ場所です。それぞれの蛋白の挙動が異なるとは考えにくいのかなと思っております。マウスでは普通に発現するのに、ヒトのconstructだけ発現しないのは非常に不思議です。 蛋白自体は培養上清に出てくるため、培養上清をカラムで10倍ぐらい濃縮してウエスタンに用いています。ただ、今回発現がヒトcDNAから見られないため、培養上清・lysate・pelletの3つのすべての成分から調べましたが、いずれもウエスタンでバンドが出ませんでした。 ヒトだけ細胞毒性があるのか？ CMV promoterがよくないのか？ 774Rさんにも指摘をもらいましたが、他のヒト正常細胞を用いるならどの細胞がいいのか？ などが分かると嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.5794-8 - 2017/03/01 (水) 04:06:59 - おお ふしぎですね。。。Tag入れて確認とかはされてないですか。抗原のエピトープ部位が修飾されるなら反応は落ちますけど。エンドでHEKには発現しているタンパク質でしょうか？というかコントロールでは検出されないんですよね。全く検出できないのを、発現してないと解釈するのか検出感度と考えるか、、、 蛋白抽出方法はどのようにしているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5794-7 - 2017/03/01 (水) 00:34:18 - KT 了解しました。 一度、COS7で試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.5794-6 - 2017/03/01 (水) 00:06:07 - 中年 ベクターがpcDNA3.1なら本来であればCOS7で高発現するはずなので、抗体の反応性とコンストラクトに問題が無いことをまずはそれで確認してみては？

(無題) 削除/引用 No.5794-5 - 2017/02/28 (火) 23:42:43 - KT そうです。ヒトの配列から合成ペプチドを選び、その部位のアミノ酸配列はマウスでも全く同じです。先にマウスの実験をしていたため、マウスcDNAから用い、次にヒトでも証明しようと思ったら、予想外のことが起きた感じです。 一度HEK293細胞以外でもトライしてみるべきでしょうか？どういう可能性を考えて他の細胞と思われたのでしょうか？できたらヒトの正常細胞を用いたいのですが、何か推奨のものはありますか？手元にあるのはサルのCOS7ぐらいです。 実は別の蛋白（ヒト）を強制発現するstable cell lineをHEK293で作ってしまっています。今回はtransientの発現実験で結果が出ませんでしたが、最終的には、別の蛋白と今回の蛋白の両方をヒトで発現する細胞株を作りたいと思っております。 （マウスでは別の蛋白と今回の蛋白の両方を発現する細胞株はHEK293ですでにできあがっています。）

(無題) 削除/引用 No.5794-4 - 2017/02/28 (火) 23:28:55 - 774R 抗体の種特異性を心配して確認させていただいたのですが、ヒトとマウスで共通のエピトープですか。 念のため、その抗体がヒトのタンパク質に反応することは確認済みでしょうか？ エピトープは全く同一ということでしょうか？つまり1残基も違いがない範囲のリコンビナントタンパク質であったりペプチドを抗原にして作られた抗体ということでしょうか？ 抗体が必ず反応するにもかかわらず発現が確認できないということであれば、HEK以外の細胞を使って発現させてみるとかでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5794-3 - 2017/02/28 (火) 23:17:11 - KT HEK293にpcDNA3.1のみをtransfectionしたものをnegative control、pcDNA3.1-mouse constructをtransfectionしたものをpositive controlとしています。 発現の確認はウエスタンブロットで、マウスとヒトで共通のepitopeに対するmonoclonal antibodyで検出しています。

(無題) 削除/引用 No.5794-2 - 2017/02/28 (火) 23:07:44 - 774R ちなみに発現の確認はどのような方法でしてますか？

マウスcDNAは発現するが、ヒトcDNAが発現しない 削除/引用 No.5794-1 - 2017/02/28 (火) 22:46:33 - KT いつも困ったときはお世話になっております。 マウスで約4kbのcDNAをpcDNA3.1に入れてHEK293細胞にtransfectionすると、問題なくstable cell lineができる遺伝子があります。 ところが、そのヒト遺伝子のcDNAをpcDNA3.1に入れてHEK293細胞にtransfectionしても発現が全く見られません。3-4回試みましたが、無理でした。作製したvectorのシークエンスは問題なく、開始コドンの直前の配列CGAACCをkozak配列（GCCACC）に変更してみましたが、やはり結果は変わりませんでした。 どのようなことを考えて対処したらよいでしょうか？ 9ヶ月ぐらい実験が滞っています。 アドバイスを宜しくお願い致します。

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