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(無題) 削除/引用 No.5786-21 - 2017/03/01 (水) 15:43:24 - 教えていただきたいです おお様 問題点はWBの見せ方です。 BとCのassociation自体は問題ないと思っています。 すみません、少し混同しておりました。ありがとうございます。 A→　 B　→ Cの経路を証明するにあたり、基本はウエスタンの動きを見ています。AをノックダウンすることでB、CでそれぞれKD細胞がdown regulateしています。 平行してmessageも見ていますので、定量のイメージを持っていただきたくコメントしました、ややこしくて申し訳ありません。(BのrescueがKD細胞の非刺激と比べて20-60倍という意味です[すごくばらつきます]) rescue？実験として、Bの濃度が上がりすぎるのが一番の問題です。 ctrl(-)、ctrl(+)、KD(-)、KD(+)の評価です。Image Jでおおよその値です。（四捨五入していますし、差がありすぎてあてにならないですが、イメージとしてお願いします） 元々 A : ctrl(-)、ctrl(+)、KD(-)、KD(+)　＝　10 : 10: 1 : 1 B: ctrl(-)、ctrl(+)、KD(-)、KD(+) = 0: 10: 0: 10 C: ctrl(-)、ctrl(+)、KD(-)、KD(+)= 2: 10: 1: 20 ２レーンではBはctrl(-)、KD(-)で 2:1くらいの差はあります。この濃度でしか、仮説は証明されないので、どうにかしたいのですが、ボスの要望が4レーンなのでどうしようもないのです。 ルミノグラフで撮影していますが、それも問題かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5786-20 - 2017/03/01 (水) 14:36:55 - おお ＞ただ、messageではおよそ60倍なんです・・・ ちょっとまってください。WBで図の見せ方の話じゃなかったっけ。一度問題点を整理していただけませんか？

(無題) 削除/引用 No.5786-19 - 2017/03/01 (水) 14:32:44 - おお そうそう蛋白レベルではmRNAと同程度以上に変化していたとしてもそんなに気にするところでもないと思います。

(無題) 削除/引用 No.5786-18 - 2017/03/01 (水) 14:17:29 - 教えていただきたいです おお様 ありがとうございます。 ただ、messageではおよそ60倍なんです・・・

(無題) 削除/引用 No.5786-17 - 2017/03/01 (水) 14:12:59 - おお ウエスタンでも検出感度（露光時間など）をうまく調整してKD(-)の発現がかろうじて検出できるぐらいに調整すればどうでしょうか。ただ隣に１０倍とか強いのがあるとそれが横のレーンを邪魔しないかな。。。１レーンおきとかにすれば回避できますけど。

(無題) 削除/引用 No.5786-16 - 2017/03/01 (水) 13:36:01 - 教えていただきたいです おお様 レーンということはqPCRではないのですね。。。PCRして泳動して染めているなら露光を落としてKD(-)で検出ギリギリのところで図を作ればどうでしょうか。 ウエスタンなんです・・・ qPCRは良いFigureは作成できているのですが、結局はウエスタンだと思います。 なので、結構難しくて困っています。

(無題) 削除/引用 No.5786-15 - 2017/03/01 (水) 13:33:27 - おお レーンということはqPCRではないのですね。。。PCRして泳動して染めているなら露光を落としてKD(-)で検出ギリギリのところで図を作ればどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5786-14 - 2017/03/01 (水) 12:59:31 - 教えていただきたいです おお様 返事が遅れて申し訳ありません。 >ctrl(-)、ctrl(+)、KD(-)、KD(+) ctrl(+)は必要ですか？ ＞上司の命令につき、これは必要らしいです（僕は全くagreeではありませんが、不自然らしいです） まず言いたいことを整理してそれに合わせて図を作るといいかと思います。 まずAのKDに於いてBとCの発現をが抑制された。 KDとそのコントロールがあればいいですよね（薬剤は加えない状態で）。これはすでに確認済みということなので図はあるわけですよね。 KDの状態において薬剤でBの誘導をしてBの発現とCの発現の関係をしらべた（レスキューとせずに両者の発現にAssociationがあるかを見たとすると従来の発現より強くなってもあまり違和感がないような気がします）。 KD(-) KD(+)があればここは事が足りますよね。 なので図を分けてパネルA、Bなどと２つ作れば見やすくなりませんか。一般的に図にはあまり情報を詰め込まない方がいいと言われることも多いです ＞僕も同意見ですが、必ず4レーンでしろということなので、どうしようもできない状態です・・・

(無題) 削除/引用 No.5786-13 - 2017/03/01 (水) 12:56:36 - 教えていただきたいです ロジック様 返事が遅れて大変申し訳ありません。 A がない状態で B を薬剤で上げた時に大量に上がりすぎて困っているのですよね？ �@A がある状態（つまり野生型細胞）に薬剤を入れるとどうなりますか？それで C が上がるならこれでもよいのでは？A がない事自体、細胞にとってはとてもartificialな環境です。おおさんや私も言っていますが、このての実験に完璧な照明は存在しないので、このやり方でうまくいくなら（いろいろな可能性は考えられるにせよ）B が C の上流にあることは言えていると思います。 Cも上がります。論法としては4レーンだして ctrl(-)、KD(-)、 ctrl(+)、、KD(+)の順にウエスタンのデータをだして、 ctrl(+)、、KD(+)でもともとあったCの差がなくなればそれでよいという上司の意見でした。 その際、差がありすぎるので左2レーンの露光を long exposure、右をshortにすれば問題ないということでしたが・・・ �A薬剤の濃度を振ってみましたか？ 振りました。この仮説に合う濃度は残念ながら急激な変化を示しており、mildな上がり方ではありません。

(無題) 削除/引用 No.5786-12 - 2017/02/27 (月) 09:20:39 - ロジック A がない状態で B を薬剤で上げた時に大量に上がりすぎて困っているのですよね？ �@A がある状態（つまり野生型細胞）に薬剤を入れるとどうなりますか？それで C が上がるならこれでもよいのでは？A がない事自体、細胞にとってはとてもartificialな環境です。おおさんや私も言っていますが、このての実験に完璧な照明は存在しないので、このやり方でうまくいくなら（いろいろな可能性は考えられるにせよ）B が C の上流にあることは言えていると思います。 �A薬剤の濃度を振ってみましたか？

(無題) 削除/引用 No.5786-11 - 2017/02/27 (月) 06:52:44 - おお >ctrl(-)、ctrl(+)、KD(-)、KD(+) ctrl(+)は必要ですか？ >Ctrl(-)とKD(-)でBに差がないように見えます。 軸はLogでなかったらLog（Fold change)で書くとどうですか？ http://peltiertech.com/broken-y-axis-in-excel-chart/ こちらのようなBroken AxisやPanel Chartを使ってはどうですか。 まず言いたいことを整理してそれに合わせて図を作るといいかと思います。 まずAのKDに於いてBとCの発現をが抑制された。 KDとそのコントロールがあればいいですよね（薬剤は加えない状態で）。これはすでに確認済みということなので図はあるわけですよね。 KDの状態において薬剤でBの誘導をしてBの発現とCの発現の関係をしらべた（レスキューとせずに両者の発現にAssociationがあるかを見たとすると従来の発現より強くなってもあまり違和感がないような気がします）。 KD(-) KD(+)があればここは事が足りますよね。 なので図を分けてパネルA、Bなどと２つ作れば見やすくなりませんか。一般的に図にはあまり情報を詰め込まない方がいいと言われることも多いです。

(無題) 削除/引用 No.5786-10 - 2017/02/26 (日) 20:42:18 - 教えていただきたいです おお様 ありがとうございます。Chipは余力があればにいたします。 一番大きな 問題はCの発現がB rescue薬で、KD細胞で100%回復するどころか、10倍程度上がってしまうところにあります。Bの発現もmessageでは20倍ほどです。 そうなると ctrl(-)、ctrl(+)、KD(-)、KD(+)の4レーンでFigureを作成すると、Ctrl(-)とKD(-)でBに差がないように見えます。Cも同様の結果です。濃度をもちろん振りましたが、この濃度でしか、Cはrescueされません。Figureの見せ方等もわかりません。 KD細胞だけ見せても良いのならば、それらしいFigureも出来ますが・・・Ctrlを見せない時点で・・・ですよね。 Bは通常は発現していないというものですが、恒常的に発現している細胞株（2種類）で実験を行っています。そもそも大して上がっていないのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5786-9 - 2017/02/26 (日) 18:49:11 - おお ロジックさんがAがBを介さない経路でもCの発現を制御できる可能性を指摘していますが、もちろんそれは可能性を否定したり突き止めることは有意義なんですが、「教えていただきたいです」さんの実験でそこを今の段階でクリアーにする必要はありますか？そこはまず考えてもいいところかと思います。またBを介さない経路なんですがAがBを介してCの発現を上げる環境を整えるために他の蛋白も制御しているならAを止めてBだけで完全にCの発現上昇が１００％回復するという風にはならない可能性があるので、A直接かどうか見分けるのに一工夫必要かもしれません。 AがBを介してCの発現を上げる環境を整えるために他の蛋白も制御しているというのを例え話でするなら、Bがリン酸化で活性化される蛋白でAはBをリン酸化する蛋白も制御しているとか。 Aが転写のcoregulatorということなのでAでChipアッセイの系があなたのラボで確立されていてBのプロモーター、エンハンサー領域などがポジティブに出るのなら、それにCのプロモーター、エンハンサー領域を加えてポジに出ないというのはありえる実験かと思います。ただ転写制御領域をどう絞り込むのか、総当り的にやるのか、Chip-seqで網羅的に抑えるのか、ストラテジーをよく考えないといけないかもしれません。もちろんCがネガティブにでてもA-D-Cのようなカスケードがあるということは否定できませんけど、A-B-Cカスケードに間接的ではありますが示唆的ではありますので、論文で書くときのトーンをうまく調整して書けばいいでしょう。 パブリッシュされたRNAseq、アレイその他のデーター、あるいはいろいろな組織の中でA、BとCの発現を調べたようなデーターでAが発現しているがBとCが発現していないという細胞群や組織などありませんでしょうか？そういうのがあればAが直接Cを制御しない可能性に対して示唆的です（もちろん完全ではありませんが）。 このような実験は多角的にみてどれがもっともらしいという風に見えるかという導き方もやっていく必要があるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5786-8 - 2017/02/25 (土) 20:27:51 - 教えていただきたいです >ロジック様 ＞　いやいや。A が直接 C をと言うのは、A が転写因子ならその可能性もありますが、さらに A と C の間に別の分子 D が絡んでいる可能性もありますから、CHIP では第一選択ではありません。また、このロジックを証明するのにいきなりそんな高尚な実験をする必要はありません。 Aは一応転写のcoregulatorなのですが、その通りですよね。ありがとうございます。 ＞　おおさんも言われていますが、薬剤を使うとそれが本当に C の発現に影響を与えないかわかりません。したがって、A,B については過剰発現するためのコンストラクト、B についてはノックダウンするためのコンストラクトを準備して私とおおさんが指摘した実験をするのがベストだと思います。B のノックダウンが難しいなら発現や機能を抑制することが証明されている試薬があるならを準備してもいいと思います。 ありがとうございます。薬剤実験はいろいろ問題がありますね。 一度tryしてみます。

(無題) 削除/引用 No.5786-7 - 2017/02/25 (土) 20:19:13 - ロジック いやいや。A が直接 C をと言うのは、A が転写因子ならその可能性もありますが、さらに A と C の間に別の分子 D が絡んでいる可能性もありますから、CHIP では第一選択ではありません。また、このロジックを証明するのにいきなりそんな高尚な実験をする必要はありません。 おおさんも言われていますが、薬剤を使うとそれが本当に C の発現に影響を与えないかわかりません。したがって、A,B については過剰発現するためのコンストラクト、B についてはノックダウンするためのコンストラクトを準備して私とおおさんが指摘した実験をするのがベストだと思います。B のノックダウンが難しいなら発現や機能を抑制することが証明されている試薬があるならを準備してもいいと思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.5786-6 - 2017/02/25 (土) 20:12:41 - 教えていただきたいです ご回答ありがとうございます。 ＞おお様 ＞その前になぜ発現でそのカスケードが証明できるのかわからないですが。。。AからBへ蛋白レベルでシグナルが伝えられるのであれば発現は２次的と思えますが。Aが発現すると、次にBが発現して、その後B依存的にCが発現するという話ですか？ その通りでございます。Aが新規タンパク質ですので、あまり既報がなく、『AがBを介してCに関与する』の仮説のもと、予算が可能な範囲で、つなぎあわせている状態です・・・。 他にはsupportするdataはvivoのデータでmessenger levelではありますがA/B/Cそれぞれに高い(Spearman's ρ > 0.7)、相関関係が見られます。 ＞　ロジック様 ＞A を過剰発現させた状態で B の発現をノックダウンした時、C の発現が完全に下がるなら、A→B→C の上下関係が一直線上にあると言えます。 こちらはreviseで良いと上司から言われました（費用の問題で、火の車です） ＞トピ主さんの実験だけでは、C は B の下流にもあるが A からも直接支配を受けているのでは？というツッコミに対応できません その可能性も考慮しています。AがCを直接制御するということは、Chip assayになるんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5786-5 - 2017/02/25 (土) 19:37:06 - おお あ、そうそう。薬剤でBを上げるなら薬剤がBを介さないでCを上げていることを否定するのが難しくないですか？Bの過剰発現ならコントロールを取りやすいですけど。

(無題) 削除/引用 No.5786-4 - 2017/02/25 (土) 19:18:55 - ロジック 多少バグりました。これでどうでしょうか。 |ーーー↓ A→B→C

(無題) 削除/引用 No.5786-3 - 2017/02/25 (土) 19:17:50 - ロジック 遺伝子発現に関する上下関係を解析されていると仮定します。 B が野生型よりも過剰になってしまうことは私ならあまり気にしません。 あくまで機能の上下関係を言うだけですから。 したがって最低限のことはできていると思います。 トピ主さんの実験だけでは、C は B の下流にもあるが A からも直接支配を受けているのでは？というツッコミに対応できません。つまり、A は B, C 両方の発現を直接コントロールしており、B 自身も A の下流で C を制御しているというパスウェイです。 無理やり書くとこんな可能性です。 |------↓ A→B→C 上記を調べるために、A を過剰発現させた状態で B の発現をノックダウンした時、C の発現が完全に下がるなら、A→B→C の上下関係が一直線上にあると言えます。

(無題) 削除/引用 No.5786-2 - 2017/02/25 (土) 15:08:20 - おお その前になぜ発現でそのカスケードが証明できるのかわからないですが。。。AからBへ蛋白レベルでシグナルが伝えられるのであれば発現は２次的と思えますが。。。 Aが発現すると、次にBが発現して、その後B依存的にCが発現するという話ですか？ それなら一応辻褄が合うのでその経路を示唆するデーターでしょう。証明と言うには（他にどんなデーターを持っているかにもよりますが）ラフだと思いますが。 発現量に関してはもとより強くてもこういう実験ではデーターとして扱うことはしばしあります。C発現回復の度合いとB発現量を絡めて考察を入れておけばいいでしょうし、その考察から突っ込んで実験ができるものであれば追加実験をしていくといいかと思います。

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