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(無題) 削除/引用 No.5778-11 - 2017/02/26 (日) 20:08:10 - 定量乙 BCAは確かにいい。

(無題) 削除/引用 No.5778-10 - 2017/02/26 (日) 19:18:13 - おお 昔だれかプリセットされたのか、昔測ったときのスタンダードがそのままレコードされていたのか知らないけど、その値をいつも使って定量している人がいましたけど、そのスタンダードがどういうバッファー中のものかも知らないでようそんなの信用するわと思ったことがあります。 まあそれでもバッファーが適切で同時に測ったサンプル間では相対的な量関係は見れるのかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.5778-9 - 2017/02/24 (金) 08:56:55 - TS 他の人も突っ込んでるけど、 ウェスタンのサンプルをBradfordでやるなら 使っているLysis bufferがComptibleかどうか確認すべきと思う。 普通のBradfordのレンジとWBのサンプル濃度を考えると、 少なくとも希釈が必要なような気がするので、 そのあたりもちゃんと確かめたらよいと思う。 まぁ無難なのはBCA法と思うんだが。

(無題) 削除/引用 No.5778-8 - 2017/02/23 (木) 21:27:25 - たろう Karlssonの方法(PMID: 8059941)でやるのはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5778-7 - 2017/02/23 (木) 17:17:06 - ノットロールアウェイ 純度99%くらいあっても測定値がブレブレになるタンパク質が稀にあります。 BCAでやると安定するかも。

(無題) 削除/引用 No.5778-6 - 2017/02/22 (水) 20:09:24 - AP みんなも突っ込んでるけど、こういう質問をしておいて、測定値の単位がついていないというのは呆れるよね。 あと機種依存文字（具体的には日本語フォントのギリシア文字のマイクロとか）はこういう所では使わないように。コンピュータの環境がいろいろな人が読むから、機種によっては字化して読めない。 Bradford assayと言っても色々変法があるので、あるいは市販品でもメーカーに寄って差異があったりするので、もうちょっと詳しく書いてくれないかな。 特に >Bradford 200µl というのがわからん。それが一般的な名称というわけでもないし、私の知っている試薬とは組成が違うかも知れないではない。自作したものなのか既製品なのか、既製品ならどこのメーカーのものか？ 既製品なら製品マニュアルの手順に忠実に従っているのか、書かれているトラブルシュートはひと通り検討済みなのか？ Bradfordの色素抱合反応は時間に依存する。色素を加えてからどのくらい時間をおいているのか、その時間は毎回一定させているか？

(無題) 削除/引用 No.5778-5 - 2017/02/22 (水) 19:02:58 - 定量乙 組織あるいは細胞から蛋白質を可溶化して遠心した上清をサンプルとして用いているものとおもいますが、この場合大切な事は、蛋白質濃度を定量したい検体が不溶物等が残存していない均一な溶液（透明で濁りや変なものが浮いていない状態）であることが大切です。遠心が不十分であったり、上清の分取の際に、沈殿物の一部が混じったり凍結融解等の反復でいったん溶けた蛋白質が変性して不溶化することがあります。こういうものがあると測定値が大きくばらつき安定しません。（とくに蛋白質濃度が非常に高いサンプルでは注意が必要です。）変なことがおこりにくい早い段階の結果ほど信頼できるとおもいます。 ほうんとうはSDS-Sample bufferで直接可溶化する（この場合、DNAの剪断は必要）のが確実とおもいますが、ブラッドフォールド法だとSDSは×なので、蛋白質定量後はできるだけ早い段階でSDS-sample bufferで処理することで改善されると思います。

(無題) 削除/引用 No.5778-4 - 2017/02/22 (水) 18:05:33 - mon > 2.4→1.7→3.3 この値は、検量線から推定したもので単位は、mg/mLですか?mg/mLだとするとサンプルが濃すぎるかもしれません。 ug/mLですか。検量線のこのレンジで直線近似出来ますか。もしそうでないなら感度が悪く正確に測れていない可能性がありますので、サンプル液量を10~50倍に増やし、検量線の直線領域に収まるようにしてみてください。 あるいはODでしょうか。ODでも飽和している可能性があります。 なお、Bradford法はSDSの影響を受けます。検量線用の標準タンパク液測定液にもSDSサンプルバッファーをサンプルと等量（この場合は2uL)入れていますか。

タンパクは 削除/引用 No.5778-3 - 2017/02/22 (水) 17:16:58 - ema ＞�@PBS 798µl�ABradford 200µl�Bサンプル 2µl 提示いただいた内容から2ulの少量なので、Nanodropか何かの少量液柱を立てて測定しているように見えます。 ＞2.4→1.7→3.3 は実測値でしょうか？判定濃度でしょうか？ 実測値がここまでぶれたら問題ですが、判定濃度だとするとその程度はぶれると思います。 ウエスタンブロット用LysisBufferには色々な夾雑物があり、非常に難しいものだと思います。 どうしても確実な値が欲しいならメルクのDirect Detect™スペクトロメーター（メルク）の方法もあると思います。（カード代高いけど）

(無題) 削除/引用 No.5778-2 - 2017/02/22 (水) 17:02:06 - おお PBSでなくて水を使ったほうがいいのでは？ サンプルはどんなバッファーに溶けているのですか？ 同時に同じサンプルを２回以上測ると（n＝２以上）どれくらいぶれますか？ キュベットはディスポですか？使ったあと中身を捨ててまた違うサンプルを入れてはかってますか？

Bradfordを用いたタンパク濃度の測定 削除/引用 No.5778-1 - 2017/02/22 (水) 16:49:27 - Dropout 初めまして。 ウエスタンブロット用の試料を作成し、分光光度計にてタンパク濃度を測定しているのですが、安定した結果が出ません。手技的な問題が大きいとは思うのですが、アドバイス等をいただけると幸いです。 概要 同一サンプルのタンパク濃度を測定しているのですが、結果が日を追うごとに異なってしまいます。 例 2.4→1.7→3.3 1.3→2.1→3.3 分光光度計で測定する手順としては �@PBS 798µl �ABradford 200µl �Bサンプル 2µl をボルテックスし、測定しております。 サンプル投入時も一定時間ボルテックスをするようにしてはおりますが、上記のようになってしまいます。

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