Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

Lipofectamine3000、2種類のDNAをCo-transfection トピック削除
No.5770-TOPIC - 2017/02/19 (日) 10:58:39 - LP
Lipofectamine3000を初めて使うんですが、プロトコールには24ウェルで1 ugのDNA（2 uLのP3000、0.75と1.5 uLのLipofectamine3000（←どちらがいいことが多いでしょう…？））とあります。

2種類のプラスミドをCo-transfectionする場合は、それぞれのDNAを1 ug、合計2 ugにしてP3000も2倍にしてLipofectamine3000も2倍にするのか、あるいは割と適当でもいい感じなのか、経験のある方いらっしゃいましたらアドバイスいただけると助かります。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.5770-6 - 2017/02/20 (月) 09:34:07 - LP
ポスドクさん、おおさん

アドバイスありがとうございます。
簡易マニュアルに目を通すだけで、説明書も読まずにフォーラムに質問丸投げするというクソっぷりでした。反省します。

いただいたアドバイスは全て完全に理に適っており実に納得できるもので、非常にありがたいです。というか、そのぐらい自分で推察立てられない感じで実験してて大丈夫なの？と、自分自身に対し恥ずかしい限りです。
ポスドクさんの後半やおおさんが触れていただいた点から、その辺含め結局KRさんのおっしゃった通り条件検討をまずすべき、という話になりそうですね。

横着をせず、常道通りまずは1種類ずつで試してみようと思います。実にためになるありがたいアドバイス、本当にありがとうございました…！

(無題) 削除/引用
No.5770-5 - 2017/02/20 (月) 08:45:20 - おお
DNAと導入試薬の割合と導入試薬の量が至適化されているようならそれを固定したほうがいいです。
なので至適条件のDNA（プラスミド量）のTotalの量を変えないで、導入試薬の量も変えないで導入するのが通常のやり方と思ってます。

(無題) 削除/引用
No.5770-4 - 2017/02/20 (月) 08:10:39 - ポスドク
説明書に、試薬およびDNA量の増減について書いてませんか？

細胞によって感受性は違いますが、基本トランスフェクション試薬は細胞障害性があるから、単純に2倍使えばそれだけで大量の細胞死を誘導する場合もありますよ。なので、二種類DNAを使うからトランスフェクション試薬も二倍、とはならないだろうと思います。

私は最初はDNAそれぞれを半量（0.5+0.5 ug）にして合計DNA量を合わせる形で試しました。たぶんこれがスタンダードなやり方ではないかと思います。

ところで、二種類のDNAを入れる目的は何でしょうか？もし、二種類の発現ベクターで違う遺伝子を発現させたいというのであれば、それぞれの遺伝子のトランスフェクション効率についてよく調べておかないと問題になることありますよ。効率が共に100%近いなら問題にならないでしょうが、そうでなければ、遺伝子Aが発現している細胞、遺伝子Bが発現している細胞、遺伝子AとBが発現している細胞、のミックスになってその割合が偏りますから。

(無題) 削除/引用
No.5770-3 - 2017/02/20 (月) 07:45:51 - LP
KRさん

それもそうですね。まずは試してみようかと思います。

…が、試すにもまずどの条件を見てみるのがベストかを知っておくのも賢い気がするので（安い試薬じゃないですし…）、複数種類のDNAを入れる場合、合計DNA量を推奨量に合わせるか、それとも全体的にスケールアップするのかどちらがいい場合が多いか、どなたか経験がある方いらっしゃいましたらアドバイスいただけるとありがたいです。

(無題) 削除/引用
No.5770-2 - 2017/02/19 (日) 11:41:12 - KR
Before asking, you need to optimize condition first.

Lipofectamine3000、2種類のDNAをCo-transfection 削除/引用
No.5770-1 - 2017/02/19 (日) 10:58:39 - LP
Lipofectamine3000を初めて使うんですが、プロトコールには24ウェルで1 ugのDNA（2 uLのP3000、0.75と1.5 uLのLipofectamine3000（←どちらがいいことが多いでしょう…？））とあります。

2種類のプラスミドをCo-transfectionする場合は、それぞれのDNAを1 ug、合計2 ugにしてP3000も2倍にしてLipofectamine3000も2倍にするのか、あるいは割と適当でもいい感じなのか、経験のある方いらっしゃいましたらアドバイスいただけると助かります。
全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。