BioTechnicalフォーラム [PCR酵素にコンタミしたゲノムやcDNAの除去]

PCR酵素にコンタミしたゲノムやcDNAの除去

No.5764-TOPIC - 2017/02/15 (水) 17:03:25 - やってしまった

いつも参考にさせていただいております。

研究生活をそれなりにしているものですが、恥ずかしながら
PCR酵素に何らかの核酸をコンタミさせてしまい、その除去をどうにかしてできないかと考えております。
（朦朧とした状態で実験していたためか、多分実験動物のcDNAかゲノムがコンタミしてしまった……恥ずかしい）

こういった状態になってしまったが、リカバーできたよと言う経験のある方、なにかアイデアなどありましたらお願いいたします。

自分で思いついているのとしては
１．KODのチューブにDNaseをちょっと入れて37℃で10分くらい放置
２．その後95℃で5分くらい熱してDNaseだけ壊してしまう
とかでしょうか。ちょっとKODにダメージが入りそうですが。

年度末で予算もカツカツで、新しいものを買おうにも買えない状態です……タイミングが悪くて恥ずかしいばかり。
宜しくお願いいたします。
　

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No.5764-10 - 2017/02/17 (金) 00:25:54 - ポスドク

PCRの目的によっては除去しなくても良いと思う。

例えば発現ベクターを作るためのPCRで増幅させる領域の配列が既知のものであれば、ゲルに流して目的のサイズのバンドを切り出してシークエンスすれば欲しいものだけ取れると思う。

仮に、template DNA抜きでPCR反応をすると欲しいサイズに似たサイズのバンドが出るので困っている、というのであれば除去する必要があるかもしれないけれど、実際のところ「コンタミ」由来のバンドであれば本来の増幅させたバンドよりもかなり薄いであろうから、TAクローニングしてコロニーを5、6個もつつけば当たりが少なくとも一つは取れるのではなかろうか。現実的には当たりコロニーのほうがマジョリティになると思うが。

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No.5764-9 - 2017/02/16 (木) 13:54:10 - おお

シーケンスするんであれば、コンタミしたcDNAからの配列か、目的のcDNA由来かで困らないか？

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No.5764-8 - 2017/02/16 (木) 13:46:27 - AP

いれたつもりのないDNAからPCR産物が出来てしまっては困る。
他の実験に比べPCR実験ではコンタミ防止にシビアなのはそういうこと。

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No.5764-7 - 2017/02/16 (木) 13:10:07 - 通りすがりの研究者

KODってクローニングに使う酵素ですか？どっちみちPCR産物は精製するんだし、そもそも除去しなくてもなんとかなったりしないでしょうか？

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No.5764-6 - 2017/02/16 (木) 10:46:39 - SYBR master

ethidium monoazide(EMA)を混ぜて、Blue lightを照射(白色LEDでOK)する方法があります。
参考文献は、PMID:17187883 およびPMID:20737013

ただEMAは、KODより価格が高いです。

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No.5764-5 - 2017/02/15 (水) 18:33:08 - AP

PCR反応を仕掛けるときに、鋳型とプライマー（とdNTP)を抜いた反応液を調製し、DNaseと終濃度1 mM程度のCa++を添加する。
37℃でしばらく反応させた後、高温でDNaseを失活。
その後、抜いておいた鋳型、プライマー等を加えてPCR。
Mg++はPCR反応液に入っているのでいいだろう。
加えたCa++がPCRのパラメータにどう関わるかわからないけれど、
Ca++ありなしでぜんぜん効き方が違うので入れたい。

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No.5764-4 - 2017/02/15 (水) 18:04:58 - AP

DNaseを効かすにはMg++またはMn++、およびCa++が必要です。
酵素保存液はそのようにはなっていないので効かないでしょう。
RNAからのゲノムDNAの除去でDNaseを入れても、Mg++やCa++加えないと全然効かないんだから。

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No.5764-3 - 2017/02/15 (水) 17:50:01 - おお

でも、酵素にコンタミしたというのは確かなんだろうか、、、酵素とか直接サンプルに入れるのはよほどのことがない限りないような気がするし。

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No.5764-2 - 2017/02/15 (水) 17:44:23 - おお

DNase Iなら不活性化に９５度ほど高くなくっていいんじゃないか？

まあ安易な方法だけどそれが手っ取り早くって現実的かもしれんと無責任ながら思うけど、、、そこまでして使うかどうかというのと完全消化のと完全失活の保証がないけど。

それより隣のラボとかから借りてくるとかできないか？