BioTechnicalフォーラム [新規タンパクの機能解析]

> 少し一般的な質問になりますが、ホモログである、という定義というか、相同性の基準はどのあたりに設定するものでしょうか？
＜この質問からヒトとは進化的に遠縁な動物由来だと想定して＞
具体的な%は難しいですね。30%以上というのは悪くはないと思います（相同性・相似性アミノ酸の分布にもよりますが）。
いきなり進化的に遠いヒトでホモログを探さず、進化上系統樹が近いモデル生物種から探していくと手掛かりが得られることも有ります（検索アルゴリズムの癖かも。今はアルゴリズムも進化しているかも）。もしかすると「ある程度の下等生物には無い」等の知見が得られるかも。
また全体的な相似性だけでなく、ドメイン（高次構造）が保存されているかも手掛かりになります。

(無題)

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No.5758-12 - 2017/02/15 (水) 10:06:04 - おお

>次に、Flagタグをつけた発現ベクターを構築し、安定発現株をつくろうとしましたが、

どうしても細胞に発現させてというなら、何かに結合してそうなドメインだけを発現させるとか、N末、C末に分けて両方解析するとか（細胞での局在が変わるとちょっと難しいかもしれませんけど）。

(無題)

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No.5758-11 - 2017/02/15 (水) 10:02:20 - おお

>実はこれを一番最初にトライしました。まず、良い抗体がありません。現在、モノクロ抗体作製を検討中です。
>次に、Flagタグをつけた発現ベクターを構築し、安定発現株をつくろうとしましたが、

色々文献をみてみますと、目的の蛋白をリコンビナントで作って（大腸菌とか）、それをカラムにつけた状態でライセートを流してトラップされたタンパク質を解析しているものも見受けられます。

(無題)

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No.5758-10 - 2017/02/15 (水) 09:05:18 - KME

KOマウスのフェノタイプはKOがこの世に存在するのかも含めてMGIで調べるのがよいのでは。

(無題)

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No.5758-9 - 2017/02/14 (火) 20:26:24 - coho

> おお様

アドバイスありがとうございます。

> 結合する蛋白をCoIPとか、アフィニティーカラムとかで回収してマスで同定することによりどんな> シグナル上に位置するのかとか、既知の蛋白が見つかったらその蛋白の機能に注目して検証してい> くとかというのもできるかと思います。

実はこれを一番最初にトライしました。まず、良い抗体がありません。現在、モノクロ抗体作製を検討中です。
次に、Flagタグをつけた発現ベクターを構築し、安定発現株をつくろうとしましたが、
薬剤選択されてきたものが発現してませんでした。
現在は、いろんな細胞株にトランスフェクションして、高発現しそうな細胞をみつけるところから
始めようかと思っています。
あと、データベースを使い倒すようにサジェスチョンいただきましたが、こちらもいろいろと
漁りまくっているところです。いかんせん、そのへんは素人ですので、どこまで確証が得られる
ものか、半信半疑ですが、詳しい方に適宜質問しもって、藁をもつかむ気持ちでやってます。

> 774R様

ノックアウトマウスのフェノタイプのデータベースなどご存知ないでしょうか？
このご時世、ありそうな気もするのですが。
私がざっくり調べたところ、理研のIMPCという組織がその手のデータベースを提供しているよう
ですが、素人ですので、他にも有用なものをご存知でしたら教えていただけると幸甚です。

みなさま、ありがとうございます。

(無題)

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No.5758-8 - 2017/02/14 (火) 20:24:57 - coho

みなさん、とても建設的なアドバイスをたくさんいただき、ありがとうございます。

> Winter-8様

サジェスチョンありがとうございます。

1. 生物を扱うのが得意であれば、大腸菌などモデル生物のホモログを探して、ノックアウトして野生型との比較をする。

がん細胞株をノックダウンしてみたんですが、特に生存や増殖性には影響がなさそうでした。
mock処理と、”何を”比較するべきか、とっかかりがないので、悩んでるところです。

2. 配列からアプローチするなら、シグナル配列の有無や膜局在性やホモロジー検索などから推測して、実験系を立てる。

核移行シグナルやtransmembrane domainもなさそうで、文献的にも細胞質局在です。
ここからどういった実験系がまずは適切か、悩んでいます。

3. 私は結晶構造解析が専門ですが、この分野では構造ゲノムプロジェクトというのがあります。機能未知タンパク質の立体構造を決定して、構造から機能を予測するというものです。構造相同性や表面電荷分布から機能予測します。

これ、いいですね。ちょっと考えてみます。現状はアミノ酸配列やconserved domainの情報から
機能を予測しようとしていますが、こういった1次配列からの機能予測ってどれくらい確度がある
ものか、と実験スタートを躊躇してます。構造解析から機能予測するほうが当然よいですよね。

> mon様

アドバイスありがとうございます。

> モデル生物にホモログがあるならInteractome検索から機能予測も出来ますね。

少し一般的な質問になりますが、ホモログである、という定義というか、相同性の基準は
どのあたりに設定するものでしょうか？昔習った生化学の授業での記憶では、30-40%マッチで
あれば、相同性が高いと言ってもよい、と先生が言われていました。

(無題)

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No.5758-7 - 2017/02/14 (火) 11:47:59 - おお

あまりImpressiveと感じないでしょうけど、そのタンパク質がどこで（どの組織で、細胞内のどこで）発現しているのか。いつ、どのタイミングで発現するのかなども機能に関しての重要な情報です。
また最近はSNPsなどを含め病気などとの関連についてどんどんデーターが出てきていますので哺乳動物の遺伝子であればそのローカス周辺で何か関連のある変異やSNPがないかとか、哺乳動物の遺伝子でなくてもある程度ホモロジーがある遺伝子が哺乳動物（特に人やマウス）にあるなら、その遺伝子座周辺を調べてみるのも手です。

(無題)

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No.5758-6 - 2017/02/14 (火) 11:27:05 - 774R

ノックアウトマウスを作る

(無題)

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No.5758-5 - 2017/02/14 (火) 11:25:18 - おお

結合する蛋白をCoIPとか、アフィニティーカラムとかで回収してマスで同定することによりどんなシグナル上に位置するのかとか、既知の蛋白が見つかったらその蛋白の機能に注目して検証していくとかというのもできるかと思います。

(無題)

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No.5758-4 - 2017/02/14 (火) 11:05:56 - mon

モデル生物にホモログがあるならInteractome検索から機能予測も出来ますね。

(無題)

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No.5758-3 - 2017/02/14 (火) 10:52:48 - WInter-8

アプローチの方法はいろいろあると思いますよ。
1. 生物を扱うのが得意であれば、大腸菌などモデル生物のホモログを探して、ノックアウトして野生型との比較をする。
2. 配列からアプローチするなら、シグナル配列の有無や膜局在性やホモロジー検索などから推測して、実験系を立てる。
3. 私は結晶構造解析が専門ですが、この分野では構造ゲノムプロジェクトというのがあります。機能未知タンパク質の立体構造を決定して、構造から機能を予測するというものです。構造相同性や表面電荷分布から機能予測します。

(無題)

削除/引用

No.5758-2 - 2017/02/14 (火) 08:30:34 - 独り言

どの生物で？
なぜその遺伝子に着目したのですか？

本当に何の考えもなしに、ランダムに機能未知のタンパク質の研究しようとしているのであれば、効率的に調べる方法は極困難です。そこに確実なアプローチがあるとすれば、すでにすべてのタンパク質の機能は解析されていることでしょう。

新規タンパクの機能解析

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No.5758-1 - 2017/02/14 (火) 07:48:14 - coho

文献情報がほとんどない機能未知のタンパク質の機能解析をしようとした場合、
どのようなアプローチをお考えになりますでしょうか？

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