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(無題) 削除/引用 No.5754-12 - 2017/02/15 (水) 16:18:39 - M 774Rさん、みなさん 色々と勉強になりました。ありがとうございます。 ＞共局在を示す場合は、本当に共局在してるせいなのか、2次抗体に2)の抗体が結合してしまっただけなのか保証がなくなります。 もっとも心配なのがこれです。やはり良く使われている抗体で示したいですし、他の方法を用いてでも何とかそれぞれの受容体の局在の意義を検討できたらと考えております。 今回、みなさんのディスカッションを読ませて頂き、本当に勉強になりました。ここで質問して良かったです。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5754-11 - 2017/02/15 (水) 12:27:05 - 774R >2次抗体が2)の抗体に結合ですね． >かってに2)の抗体が2次抗体に結合だと勘違いしていました． どっちの表現でも2者が結合してることに変わりはありませんが、時系列的に2次抗体が先に標本に結合していて、後から2)の抗体が結合するので、 「2)の抗体が2次抗体に結合する」 と表現してあります。 >ところで，そのシグナルは結構検出されますか？ 2)の抗体の反応性次第ですね。本来のエピトープに対する反応が強ければ、2次抗体に結合したシグナルは気にならないし、逆だと問題となります。 実際、1)と2)の局在が違うということを示す目的であれば問題ないかもしれませんが、共局在を示す場合は、本当に共局在してるせいなのか、2次抗体に2)の抗体が結合してしまっただけなのか保証がなくなります。

(無題) 削除/引用 No.5754-10 - 2017/02/14 (火) 18:59:19 - よっしー >[Re:8] 774Rさんは書きました : > 抗体って2価ですよね。 > 2次抗体も2価ですから、片方の手は1)の抗体に結合してますが、もう片方の手が空いています。そこに2)の抗体が結合するという寸法です。 2次抗体が2)の抗体に結合ですね． かってに2)の抗体が2次抗体に結合だと勘違いしていました． ところで，そのシグナルは結構検出されますか？ 私は今まで検出したことが無いのですが，運がいいだけかなぁ・・・ ANOさんの仰るように，蛍光標識1次抗体は暗いですね．特に緑は．

(無題) 削除/引用 No.5754-9 - 2017/02/14 (火) 09:44:58 - ANO いずれにせよ、標識第2抗体を用いないで、標識第1抗体を使う場合には、発現量の多いターゲットでない限り、暗いですよ

(無題) 削除/引用 No.5754-8 - 2017/02/13 (月) 19:34:30 - 774R よっしーさん、 >1)は受容体Aに対する抗体で，2)はFITCが結合した受容体Bに対する抗体ですよね． >なぜダメなのでしょうか？ >受容体Bに対する抗体が最初に使った2次抗体に結合・・・ >私は何か勘違いをしてるのかな・・・ 抗体って2価ですよね。 2次抗体も2価ですから、片方の手は1)の抗体に結合してますが、もう片方の手が空いています。そこに2)の抗体が結合するという寸法です。

(無題) 削除/引用 No.5754-7 - 2017/02/13 (月) 19:29:19 - mbb 1次抗体をAlexaのスクシンイミドとかで 自分で直接蛍光標識してもいいと思います。 ただ、それなりに手間と時間と材料費が かかるのですが。

(無題) 削除/引用 No.5754-6 - 2017/02/13 (月) 18:44:13 - M FITC の結合部位と二次抗体の結合部位は違うのかな？と安易に想像していたのですが、conjugate がどういう形で作られているのか詳しくないのでわかりません。でも決して安くないのと、確実でないためにreviewerに問い詰められても正確に答える自信が無いため、違う方法で１）の受容体と２）受容体の関与（局在ではなく）を示す方法を考えたいと思います。in situ hybridization とかも検討したいと思います。 どなたか、in situ hybridization 以外の良い方法をご存知でしたらご教示下さると大変心強いです。 どうぞ宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.5754-5 - 2017/02/13 (月) 17:49:38 - よっしー >[Re:2] 774Rさんは書きました : > 1)の1次抗体だけ先に反応させてから2次抗体を反応させて、その後に2)の抗体を反応させれば良さそうに思えてしまいますが、2)の抗体が1)で使った2次抗体に結合してしまうのでこれもダメです。 1)は受容体Aに対する抗体で，2)はFITCが結合した受容体Bに対する抗体ですよね． なぜダメなのでしょうか？ 受容体Bに対する抗体が最初に使った2次抗体に結合・・・ 私は何か勘違いをしてるのかな・・・

(無題) 削除/引用 No.5754-4 - 2017/02/13 (月) 16:56:35 - ANO やったことありませんが、 　1)の1次抗体だけ先に反応させてから2次抗体を反応させて、 　ＰＦＡなどで固定をして 　その後に2)の抗体を反応させれば どうでしょうか？

ありがとうございます 削除/引用 No.5754-3 - 2017/02/11 (土) 23:31:46 - M 774Rさん ここで聞いておいて本当に良かったです。 年度末の予算と時間に限りある時期だったので、危うく購入するところでした。 大変勉強になりました。違う実験を考えることにします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5754-2 - 2017/02/11 (土) 23:09:04 - 774R 二次抗体はFITC conjugatedの有り無しに関係なく反応してしまうので、1)と2)両方の1次抗体に対して反応してしまいますよ。 1)の1次抗体だけ先に反応させてから2次抗体を反応させて、その後に2)の抗体を反応させれば良さそうに思えてしまいますが、2)の抗体が1)で使った2次抗体に結合してしまうのでこれもダメです。 2)の抗体を反応させるために過剰量のrabbit IgGで2次抗体の結合部位をブロックさせてから2)の抗体を反応させる方法があるらしいですが、自分はやったことがないのでどの程度うまくいくのか知りません。 やはり、種が同じ場合は、それぞれの抗体を直接標識するのが普通だと思います。

FITC-conjugated を使った蛍光二重染色 削除/引用 No.5754-1 - 2017/02/11 (土) 22:08:23 - M 初歩的な質問で本当にすみません。 現在２つの異なる受容体の蛍光二重染色をマウスの脳で行いたいのですが、抗体について調べたところ、どちらも免疫動物が同じものの抗体しか見つかりません。しかし、一つはFITC-conjugated の抗体が出ていたので、それを使えばもう一つの抗体の免疫動物を気にしなくてもできるかな？と考えているのですが、自信がありません。 以下の組み合わせ（どちらもマウスとriactivityあり）で蛍光二重染色ってできますか？ １）一次抗体の免疫動物が rabbit で、二次抗体は anti-rabbit IgG Alexa555 ２）免疫動物が rabbit の一次抗体で FITC-conjugated のもの 上記の FITC-conjugated の一次抗体を購入前に、どなかた教えて下さると助かります。 よろしくお願いします。

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