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細胞を使った取り込み実験について トピック削除
No.5747-TOPIC - 2017/02/09 (木) 11:20:03 - さし
いつも参考にさせていただいております。
現在、接着細胞を用いて薬剤の取り込み実験を行っているのですが、2点ほど調べても答えが見つからずわからないことがあります。

大まかな方法としては、文献を参考にしているのですが、
24wellに播いて、4日ほど培養後、buffer(37℃)で3回洗浄後、薬剤を添加し取り込ませ、buffer(4℃)で3回洗浄し、NaOHで細胞を溶解させ、HClで中和した後に回収し、LC-MSで定量するといった手順です。

そしてわからない2点が以下です。

・4℃での洗浄を速やかにやることがポイントだというのですが、明確な理由がわからない
4℃が大いなるダメージになるからでしょうか。そのあと溶解するのでそんなに関係するのだろうか…と、知識および経験不足のため少し疑問に感じました。ここでダメージを与えるとせっかく薬剤を取り込んだ細胞が死んでしまうのかもしれませんが、死んだ場合定量ができなくなるとかでしょうか。

・NaOHで細胞を溶解させる一般的な時間
自分は5，6時間経ってもなんだか小さな塊？のようなものがあり、溶け切りませんでした。検索したところ似たような方が以前この掲示板にいらっしゃったので、それに対するコメントを参考にもしましたが（あたためたり）変わらず…。それで5，6時間って長くないだろうか？長くなることで定量する薬剤に何か変異が起きてしまったりとか…と思いまして、お聞きしています。

この質問をさせて頂いている理由としましては、2，3度実験を行ったのですが定量結果があまりにも少なかったり、ばらつきが大きかったりで。考えた結果この2点に問題があるように感じたためです。

1点のみでもかまいません。まだ研究室に配属されて間もないため、勉強も足らず経験も足らず大変恐縮ではありますが、もし何か思い当たることがある方がいらっしゃいましたら、ご教授頂ければ幸いです。宜しくお願いいたします。
　
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No.5747-5 - 2017/02/09 (木) 16:38:35 - さし
皆さんコメントありがとうございます。助かります。

＞おおさん
なるほどです。参考になりました。4℃のbufferと何も起こらないようにということもあるのですね。ありがとうございます。

＞肉さん
そのような操作が一般的ということもあるのですか…知りませんでした。その場合は目的物がスピンダウンにより沈殿してしまうなどはないのですかね…。ちょっと文献を探してみようと思います。

＞pさん
細胞外への排出ですか、そこまで考えが及びませんでした、確かにそうですね。
参考というかほとんど同様の操作を行わせてもらった文献でもMSで検出していたのと、同じ方法を採用している文献も1つではなかったので、適当ではない可能性は考えてませんでした…。安定性はやはりよくなさそう？ですね。しかも5,6時間もさらしてたので…。
違う方法を採用しているものも探してみようと思います。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.5747-4 - 2017/02/09 (木) 15:17:38 - p
昔似たようなことをやっていましたのでご参考までに。

＞4℃での洗浄を速やかにやる

取り込んだ薬剤の細胞外へのエフラックスを抑えるため。
（排出トランスポーターがある可能性を考慮して）

＞NaOHで細胞を溶解させる

RIを使った場合は薬剤の安定性は考慮しなくていいので、一番簡便な方法として使っていました。
MSで検出する場合は、適当でない可能性があります。

(無題) 削除/引用
No.5747-3 - 2017/02/09 (木) 12:54:51 - 肉
naohで細胞を溶かす操作、入れたあとにプレートをゆすってピペッティングで完全に均一化し、エッペンに回収してスピンダウン、上清の一部を回収して中和、解析に用いる
みたいな手順が普通じゃないのかと思いました。

(無題) 削除/引用
No.5747-2 - 2017/02/09 (木) 12:17:37 - おお
＞4℃での洗浄を速やかにやる

酵素反応など細胞内の生理的活動を抑制して最大限培地を抜いたときと同様の状態を保つ。洗浄で使う溶液に対する細胞の反応を最低限におさえる。

＞NaOHで細胞を溶解させる

これは見るものによって大いに変わりますのでなんとも言えません。その見たい物質の抽出方法として確立されているのかもしれません。おそらくすべてを溶かさず必要でないものは溶けなくてもいいような条件にしておいて、検出のときにじゃまになったりバックグランドが上がったりなど避けるということも一つの要素かもしれません。

細胞を使った取り込み実験について 削除/引用
No.5747-1 - 2017/02/09 (木) 11:20:03 - さし
いつも参考にさせていただいております。
現在、接着細胞を用いて薬剤の取り込み実験を行っているのですが、2点ほど調べても答えが見つからずわからないことがあります。

大まかな方法としては、文献を参考にしているのですが、
24wellに播いて、4日ほど培養後、buffer(37℃)で3回洗浄後、薬剤を添加し取り込ませ、buffer(4℃)で3回洗浄し、NaOHで細胞を溶解させ、HClで中和した後に回収し、LC-MSで定量するといった手順です。

そしてわからない2点が以下です。

・4℃での洗浄を速やかにやることがポイントだというのですが、明確な理由がわからない
4℃が大いなるダメージになるからでしょうか。そのあと溶解するのでそんなに関係するのだろうか…と、知識および経験不足のため少し疑問に感じました。ここでダメージを与えるとせっかく薬剤を取り込んだ細胞が死んでしまうのかもしれませんが、死んだ場合定量ができなくなるとかでしょうか。

・NaOHで細胞を溶解させる一般的な時間
自分は5，6時間経ってもなんだか小さな塊？のようなものがあり、溶け切りませんでした。検索したところ似たような方が以前この掲示板にいらっしゃったので、それに対するコメントを参考にもしましたが（あたためたり）変わらず…。それで5，6時間って長くないだろうか？長くなることで定量する薬剤に何か変異が起きてしまったりとか…と思いまして、お聞きしています。

この質問をさせて頂いている理由としましては、2，3度実験を行ったのですが定量結果があまりにも少なかったり、ばらつきが大きかったりで。考えた結果この2点に問題があるように感じたためです。

1点のみでもかまいません。まだ研究室に配属されて間もないため、勉強も足らず経験も足らず大変恐縮ではありますが、もし何か思い当たることがある方がいらっしゃいましたら、ご教授頂ければ幸いです。宜しくお願いいたします。
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