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(無題) 削除/引用 No.5737-4 - 2017/02/07 (火) 13:30:00 - おお Membrane-permeable luciferinは細胞内に入ってエステラーゼと反応して初めてルシフェラーゼの基質になるようですが、もし何らかの原因で（細胞が死んだりとか）エステラーゼが細胞外に拡散していてMembrane-permeable luciferinと反応していたら細胞内に入れないし、細胞膜にいくらか障害があったほうが細胞内に入りやすいとすると、測定時期によっては強いシグナルが得られるかもしれないと、色々妄想をめぐらしているのですが、、、 Membrane-permeable luciferinを加えてから細胞を洗っているのですか？もしそうなら洗ったあとから加えたらどうなりますか？Membrane-permeable luciferinじゃなくってふつうの luciferinで細胞を洗ってからLysatesにして測ればどうなりますか？

(無題) 削除/引用 No.5737-3 - 2017/02/07 (火) 10:52:12 - a 腫瘍細胞膜をCFSE等で蛍光ラベルしておく方法はどうでしょうか。ただこの場合でも、分裂するごとに蛍光強度は低下してしまいますが、エフェクターが発光することはありません。 こういった細胞傷害試験では、ターゲットの細胞増殖を止めておくものだと思っていましたが、増殖阻害しないやり方もあるんですね。

(無題) 削除/引用 No.5737-2 - 2017/02/06 (月) 14:01:36 - おお ちょっとルシフェラーゼのほう何が起きてて何が問題なのかイマイチわかってないのですが、、、Secreted Luciferase Reporter Systemとか言うものもあるようですから、何を使っているかも関係あるかもです。 GFPなどをの発現ベクターをステイブルに発現しておけば、GFPの蛍光強度で測れると思いますが、、、

CTL/生細胞およびルシフェラーゼアッセイについて 削除/引用 No.5737-1 - 2017/02/06 (月) 10:40:23 - いなかのかわうそ 実験超新人で申し訳ないのですが， ご存知の方いらっしゃいましたらお教えくだされば幸いです． よろしくお願い申し上げます． マウスの腫瘍細胞株と，健常人から採取して分離したヒト単核球(hMNC)を，割合を変えて96wellで混合培養し，マウス細胞の数の減少を確認したいと考えています． 定量性に優れていなくても，ヒト細胞の増加に従ってマウス細胞が減る現象が確認できればいいです． マウス細胞にルシフェラーゼを導入して，細胞破壊しないルシフェリンを入れてIVISで観察しましたが，培養液を洗っても，細胞外に出たルシフェラーゼたんぱくによると思われる自家蛍光のような発光が強く，ヒト細胞が多いほうがたくさん発光してしまい，うまくいきませんでした． また，ATPアッセイや，例えばPromega製品のCelltox Greenのような試薬も調べてみましたが，どれも，エフェクター細胞の破壊も拾ってしまうため，自分の系にはあまり適さないのではないかと思います． FACSで解析も考えたのですが，FACSは感度は非常に優れていますが，取り込みした細胞内での割合が分かるのみで，マウス細胞株が増殖するのに合わせて全体の細胞数を把握することは難しいと考えました． このような系に使える蛍光，アッセイ法など，なにかいい方法ございますでしょうか？ 稚拙な質問で申し訳ございませんが，ご存知の方，ご教示くだされば幸いです．よろしくお願い申し上げます．

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