いつも参考にさせていただいてます。
FISHのシグナルが特定条件でなくなってしまったことで悩んでいます。
プローブは120kbp近くのBACをニックトランスレーションでビオチンorDIGで標識して使用しています。
もともとDNA FISHを行っていた時は培養細胞を遠心してチューブに集め、低張処理後、カルノア固定液を用いて固定してFISHを行っていました。この状態の細胞では確かにBAC由来のシングルコピーのシグナルが見えていました。
その後、RNA FISHとDNA FISHを併用して行うために固定条件等を変更しました。DNA FISHの確認として同じ種類の細胞をカバーガラスにて培養し、膜透過処理後、4%PFAにて固定し、上記のカルノアと同条件もしくはさらにきつめのdenatureを行ってFISHを行ったのですが、シグナルが見えなくなりました。BAC上の反復配列が載っていることもなく、単純に何もシグナルが出ていないように見えています。
また、FISH自体の確認のため、telomereプローブを作りFISHをやったところPFA固定、カルノア固定どちらの条件でもシグナルが確認できました。
単純にBAC由来のシグナルだけが出なくなってしまったという自分には不可解な状況です。
もし、何か心当たり、アドバイスあれば何でもよろしくお願いします。
足りない情報があればすぐに追記いたします。 |
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