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(無題) 削除/引用 No.5734-10 - 2017/02/06 (月) 14:49:11 - AA プロモーター以外にも、プラスミドの各エレメントがどういう役割を持っているのか、 よく勉強してみたほうが良さそうです。

有難う御座います。 削除/引用 No.5734-9 - 2017/02/06 (月) 10:59:02 - かけだし大学院生 Ooo、肉さん＞ 大腸菌はアンピシリンでセレクションはしましたが、ピューロマイシン耐性遺伝子が入っているのでピューロマイシンでもセレクションがかかるか、知りたかったのです。 返信有難うございます。 おおさん＞ hPGK、、、成る程、哺乳類系細胞でしかピューロマイシン耐性遺伝子は発現しないようになっているのですね。凄いですね。。。 大変分りやすかったです。プロモーターの意味をちゃんと考えようとしていませんでした。有難う御座います。

(無題) 削除/引用 No.5734-8 - 2017/02/06 (月) 10:15:38 - おお ピューロマイシンでは大腸菌でセレクションがかからないような気がしますね。 Adgeneのプラスミドのインフォメーションは不親切でみにくいですが、以下のURLでpuroRの前にあるhPGKはなんだかわかりますか？Mammalの細胞で働くプロモーターですよ。たまにMammalのプロモーターとバクテリアのプロモーターを直列に繋いで両方で発現できるようにしてある物もありますが、それならちゃんと表記があるはず。 こういうマップを読めるようにしておかないと、プラスミドを使うときにどんなプラスミドなのかわからず使っていることになってしまうんじゃないでしょうか。それぞれよくわからない表記はちゃんと調べて覚えてください。 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/library-information/vector-map.html ampR Ampicillin resistance gene for bacterial selection puroR Puromycin resistance gene for mammalian selection

データシート 削除/引用 No.5734-7 - 2017/02/06 (月) 09:37:59 - 肉 トピ主さん、データシートの下の方のインフォよく読んだ？ ピューロは細胞のセレクション用、大腸菌のトラホメはアンプと明記されてますよ。

(無題) 削除/引用 No.5734-6 - 2017/02/06 (月) 09:35:39 - Ooo AmpR...

プラスミド名ー配列 削除/引用 No.5734-5 - 2017/02/06 (月) 09:25:31 - かけだし大学院生 おおさん＞ 返信有難う御座います。プラスミドはpPKO-puroです。 https://www.addgene.org/8453/ 配列です。 mon、サンショウウオさん＞ 100-125 μg/mlとありますね。有難う御座います！この情報が欲しかったんです。。。添付のプラスミドが取り込まれた大腸菌で耐性は発現するのでしょうか。。。 IRES配列は無さそうですが、、、

(無題) 削除/引用 No.5734-4 - 2017/02/05 (日) 02:04:27 - おお プラスミド名など開示できませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5734-3 - 2017/02/04 (土) 21:05:20 - サンショウウオ 　そのベクター、大腸菌のセレクション用にアンピシリン、カナマイシンやクロラモフェニコールとかの耐性遺伝子がどれか入ってるんじゃないでしょうか？ 　 　IRES-puro耐性　とかだったら、大腸菌ではなく培養細胞じゃないと耐性発現しませんよねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.5734-2 - 2017/02/03 (金) 10:49:15 - mon まず、ピューロマイシンはとても高価です。 大腸菌でも100ug/mL以上で選択できますが、いくらかかる計算した方が良いです。 http://www.invivogen.com/PDF/Puromycin_TDS.pdf > ピューロマイシン耐性遺伝子を含むplasmidが形質転換されている大腸菌です。 そのplasmidは大腸菌でピューロマイシン耐性遺伝子が発現するようにデザインされていますか? 具体的には大腸菌用プロモーターと翻訳開始用のrb(SD)配列がありますか（場合によおては転写終結シグナル）。 ほとんどのベクターは培養細胞での選択（発現）用にデザインされていますから、ご注意ください。

ピューロマイシンと大腸菌 削除/引用 No.5734-1 - 2017/02/03 (金) 10:28:57 - かけだし大学院生 ピューロマイシンは真核生物のセレクションに使われる抗生剤ということですが、、、 大腸菌もセレクションできるのでしょうか、、、適切な濃度など分かる方いらっしゃいますでしょうか。 ピューロマイシン耐性遺伝子を含むplasmidが形質転換されている大腸菌です。 真核生物に効果がある1μg/mlでLB培地で作りました。しかし、耐性を持っていないnegative controlの方の大腸菌も生えてきてしまったので、抗生剤が効いていないのだと思います。。。濃度の問題なのでしょうか、、、それとも、そもそも大腸菌には効かない？？のでしょうか。 ピューロマイシン耐性遺伝子の効果を大腸菌で確認することはできないのでしょうか。。。

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