全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5733-12 - 2017/02/05 (日) 02:03:09 - おお >二層分離ゲルについてなのですが， >失礼なのですが論文への掲載例ってありますでしょうか？ ここで少し前にも話題になりました。確か論文があったように記憶してます。時間があれば過去ログを検索してみます。

(無題) 削除/引用 No.5733-11 - 2017/02/04 (土) 21:08:13 - サンショウウオ https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/casting-gradient-gels グラジエントゲルは、シリンジポンプ2本を電子制御して自作できます。

二層分離ゲルと電流・電圧に関して 削除/引用 No.5733-10 - 2017/02/04 (土) 13:07:14 - いんせーい いろいろとご指摘ありがとうございます。 分離ゲルへのグリセロール添加は知らなかったです。 二層分離ゲルについてなのですが， 失礼なのですが論文への掲載例ってありますでしょうか？ 私の分野で見たことがないものですので・・・。 あと電流・電圧はどっちが完全に良いってわけではないと思いますが， この問題に関してはどっちがよいでしょうか？ 指導教官には100Vでじっくりと泳動しなさいと言われていて， （高分子を基本的には観察したいので） 実際に電流よりもキレイに分離できたり，スマイリングも起きずうまくいっているのですが，そこまで拘る必要もあるのかと思います。どうなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5733-9 - 2017/02/03 (金) 18:58:36 - p 裏技というほど大げさなことでないけど、低分子量領域の個々のバンドをシャープにして分離を良くしたいならば、発熱が問題にならない範囲で通常よりも電流／電圧を上げて、なるべく短時間で泳動を完了した方がいい。そのためにはrunning bufferによる両面冷却式の泳動槽（ゲル板がrunning buffer中に沈むタイプ）の方がいい。 低分子量領域はどうしても泳動中に徐々に拡散してバンドのシャープさが低下ししやすいが、これは泳動時間で左右される。で、ミニゲルで160minは長過ぎとおもう。 ミニゲル／両面冷却式／ゲル１枚あたり２０〜３０mA定電流で75~90minで完了してるが、低分子量領域（〜15KDa)含めて良好な泳動像を得ている。 SDSだけでは泳動中に凝集しやすい蛋白質を分析するときに、SDSゲルに高濃度の尿素を添加する場合があるけど, これやるとあるていど分離も向上する。特に低分子量領域では改善が見られる。

(無題) 削除/引用 No.5733-8 - 2017/02/03 (金) 10:34:16 - まっくろん 　うちでも自作の2層分離ゲルでやってます。うちの作り方は・・・ 　 　1) 分離ゲル下層側のゲル（例えば12%）を作る。その際、水の一部をグリセロール（最終濃度10%）に置き換える 　2)分離ゲル上層側のゲル（例えば5%）を作る。 　3)ゲル板に下・上の順で流し込む（比重の影響で，ゆっくり入れたら混りません） 　4) 水 or ブタノールでフタをして放置して固める 　5)以降，通常のSDS-PAGE 　今のところ泳動が特に乱れることなく，それなりに流れます。また，48hくらいなら，乾燥に注意して冷蔵保存して使っています。

(無題) 削除/引用 No.5733-7 - 2017/02/03 (金) 10:03:00 - 中年 低分子量のタンパク質が抜けてしまう問題については、こういうのはどうでしょうか？ http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2012/biotechforum.cgi?start=1;mode=view;Code=4740

(無題) 削除/引用 No.5733-6 - 2017/02/03 (金) 09:14:19 - mon 未検証ですが Tris-MOPS-SDS Running Bufferで高分子・低分子側の分離が良くなるらしい。 高電圧で泳動時間も短縮出来るらしい。 50mM Tris, 50mM MOPS, 0.1% SDS and 1mM EDTA (pH 7.7:調整不要?) で20xStockが市販されています。

(無題) 削除/引用 No.5733-5 - 2017/02/03 (金) 00:29:28 - おお >ゲルにですか？ yes 分離ゲルのみ もし泳動時間が長くてもよく、分解能を上げたいなら（Tris- Glycine ）の系で分離ゲルのTrisの濃度を６００mMほどに上げると個人的にはきれいに流れてると思ってます。

条件とグリセロール 削除/引用 No.5733-4 - 2017/02/02 (木) 23:25:18 - いんせーい >pさま 説明不足な点がありました。 条件は以下です。 ゲルサイズ：ミニゲル 電圧時間：100V，160 min程度 見たいタンパク：80〜50 kDaが主ですが， 分解しているかといったチェックも行いたいときもあって10 kDaもできたら見える具合がいいです。欲張りですみません。 ゲル濃度：10%です。 12%だと80kDa付近の分離が悪く，７％だと低分子が見えなくなったりします。検討不足な点はあります。 未精製のクルードなサンプルで，コントロールとの微妙なバンドの差の比較を行おうとしています。 >おおさま グリセロールを添加するというのはゲルにですか？

(無題) 削除/引用 No.5733-3 - 2017/02/02 (木) 23:23:06 - おお グリセロールを５ー１０％位入れてます。あと泳動層を冷やして温度を低温に保てるなら電圧を上げれますが、スピードは温度にも依存しそうなので、、、

(無題) 削除/引用 No.5733-2 - 2017/02/02 (木) 23:05:39 - p ゲルサイズはだいたいどのくらいですか。（ミニゲルですか？）通電を開始してから泳動完了までどのくらいの時間を要するのですか。見たい蛋白質のおよその分子量はどのくらいですか。ゲルの濃度はどのくらいですか（あるいはグラジェントゲルですか）。

SDS-PAGEの短時間かつ分離能をよくする方法・他裏技など 削除/引用 No.5733-1 - 2017/02/02 (木) 22:47:03 - いんせーい いつもお世話になります。 SDS-PAGEをいつも100V固定で行っています。 これ以上，電圧をを増すと分離が悪くなってしまいます。 また，ゲルを低濃度にすると低分子の領域が見えなくなってしまい困ります。 グラジエントゲルを購入するのも無駄遣いですし，自作する技術もありません。 なんとか，時間を短縮する方法はないものでしょうか？ また，SDS-PAGE関連で何か裏技やいいwebページがあれば教えてください。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---