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(無題) 削除/引用 No.5704-7 - 2017/02/04 (土) 11:28:34 - 遠心太郎 パーコールとかだと、それ自体は緩衝液でないので、10xPBSとPercol原液を1:9で混ぜたものを便宜的に``100%`` パーコール液（すなわちほんとうは90%パーコール)として、この``%濃度``にもとづいて濃度を計算してPBS等で希釈して各種濃度のパーコールを作成することが（習慣的に）多いのですが、Optiprepもたぶん同じようなものとおもうのですが、この辺りは大丈夫でしょうか。論文著者は17.6%とか8.2%という数値をどちらを念頭にして記載したかでだいぶ話が変わってくるとおもうので。こういう実験ばかりやってるところだと、これがスタンダードになっていて、（みんな当然知っているとおもうのか）いちいちことわらないかもしれないので。

(無題) 削除/引用 No.5704-6 - 2017/02/02 (木) 14:30:38 - 仲 トピ主です。みなさま約1週間ほど頂戴しまして、みなさまからのご助言を参考にトライしてみました。まずはたくさんのご意見を聞かせていただき、心より御礼申し上げます。ありがとうございます。 はい、温度に関しては無頓着でした。参考にしている論文にも温度は明記されておらず、これまで4度で全て行っていました。ただ、みなさまからのご意見を頂戴したのち、google scholarで調べましたところ、Optiprepは室温で用いておられる方が多いことに気づきました。そこで昨日と今日再度トライしてみましたが、室温にしてもやはり目的の細胞は得られませんでした。そもそも細胞が浮遊している印象を持ちません。 このプロトコルによりますと、肝臓実質細胞を最初の低速スピンで落としたのち、上清をやや高速遠心して、得られたペレットをOptiprepで懸濁するというものです。 その後、濃度の異なるOptiprepを細胞懸濁液に重層し、遠心（アクセル、ブレーキ共にOffです。）するのですが、これは論文にならい、50 ml tubeで行っています。 下層および上層がそれぞれ約20 mlほどあります。もちろん遠心前には秤量し、同じ重さのバランスtubeを対角に置いて遠心しています。 ここで再度質問があります。 この20 mlの細胞懸濁液が30分の1500 x gの遠心の間に中間層にこなくてはなりませんが、この20 mlを減らしたら、もう少し集まりやすくなるのでは？と考えています。他に案が浮かばないというのもあるのですが、、引き続きみなさまからご意見いただけますと嬉しいです。 ちなみにtoto様から言われた肝臓実質を除くことなく、まずはバルクでOptiprepに供するというプロトコルは明日行う予定でいます。

(無題) 削除/引用 No.5704-5 - 2017/01/25 (水) 11:47:08 - 遠心太郎 パーコールやフィコール等の媒体をつかった比重による遠心分離では温度条件がとても重要なので（実際、温度条件が異なると分離パタンもかなり違ってくる）、参照する文献でも何度で分離したときの話かは確認下さい。遠心後も溶液自体の温度が設定温度に達するまで時間がかかることまで考えて、たとえばもし条件が4°Cならgradientを作成後に1~2時間くらい冷蔵庫にいれておくとかいった注意が必要です。もちろん、サンプルアプライなどで室温にだしたりもするし現実には完璧には無理ですが、できるだけその温度に近くなるような努力をするだけでもかなり改善されるとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.5704-4 - 2017/01/24 (火) 14:35:02 - おお 細胞ではなかったかもしれませんが、密度勾配遠心で下から上に浮いてくるようなプロトコールはやったことがあったと思います。

(無題) 削除/引用 No.5704-3 - 2017/01/24 (火) 13:19:11 - よっしー 私はいつも細胞を下に入れて，遠心して浮いてきた細胞を回収しています． 細胞が採れないのは，温度設定に問題があるのではないでしょうか？ 私はいつも25度に温めた溶液を用いて，25度設定の遠心機で遠心しています． 温度が変われば比重は変わりますので．

(無題) 削除/引用 No.5704-2 - 2017/01/24 (火) 11:47:41 - toto この論文は読めないのですが、細胞の密度が溶液よりも軽ければｇを加えれば浮いてくるので、ありえないことでは無いです。一端、沈殿になった細胞を懸濁する操作が気になるところで、このときに個々の内皮細胞が分散してますでしょうか？強く懸濁すると細胞がダメージを受けるので、なかなか気を遣うところではあります。 この沈殿操作を行わずに、直接、濃い濃度のOptiprepをまぜて17.6％として遠心するというのでも同じような細胞集団が取れてくるはずですが、どうでしょうか。

Optiprepを利用した密度勾配遠心法での細胞分画に関して 削除/引用 No.5704-1 - 2017/01/24 (火) 10:22:57 - 仲 お世話になります。 マウス肝臓から血管内皮細胞の分取を始めました。 論文に倣い、肝臓をコラゲナーゼとDNAaseで処理したものを低速で遠心し、肝実質細胞を除外した後に、やや高速で上清を遠心して得たペレットを、Optiprepに懸濁しています。（これを溶液Aとさせてください。Optiprepの終濃度は17.6％です。） この溶液Aを50mlチューブに入れ、その上に慎重に8.2％のOptiprepを重層しました。 これを遠心し、その中間に目的の内皮細胞が選択的に回収されるということになっています。 ただ、いくらやっても中間層に細胞は認められません。 よくよく考えると、重力に逆行して目的の細胞が下層から中間層に移動するは本当に正しいのか？不安に思えて来ました。参考にしている論文は2016年の数ヶ月前にパブリッシュされたものです。 私はこれまでにパーコールを用いて末梢血より単核球細胞を分取していましたが、その際にはパーコールをまず下層に入れ、その上に末梢血を重層していました。下層には赤血球が移動し、中間層に血小板や単核球細胞が回収され、上層は血漿になりました。これだと重力に従っていますので、中間層に目的の物が残るというのはすんなり理解できるのですが。。 皆様からのご意見を聞かせていただけますと幸いに存じます。 以下が参考にしている論文になります。どうか、よろしくお願い致します。 sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482716303597

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