全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.569-9 - 2012/05/31 (木) 00:55:49 - Dakogilent 挽きたて様お待ちしておりました。 よこから様のコメントも遠心不要論を後押しする情報で感謝いたします。 一概に非特異と言っても、担体「基材（表面）」への非特異結合（基材選択性もある程度関与するでしょうが）、抗体自身の非特異結合から、非特異的に結合したタンパク質を介した二次的な非特異結合まで・・・ 変性抗体の話は目から鱗でした。ということはウェスタンでも起こりうることですよね。とは言え、少しは話が脱線しそうなので担体基材「表面」への結合に絞ってまずは話を進めたいと思います（二次的な非特異も低下するので）。 （以下はあくまで推論ですので、経験も根拠も自信も何もありませんが・） 非特異という言葉は、意図しない（目的物じゃない）結合ということですが、どの程度選択性が存在するのか？ つまりは、ウェスタンのブロッキングで言われる疎水性結合のブロックだけでなく、（表面の）この基材に対してはこのタンパク質が結合しやすいよ〜！という選択性の情報をご存知の方は居られますでしょうか？ 　仮に疎水的吸着の寄与が多ければ、ウェスタンと同パターンの対処である程度防げそうに思われます（ブロッキング剤への二次的結合が新たに発生するかもしれませんが）。 　静電的な影響が大きければイオン強度やpHでコントロール出来そうです（本来の特異的な相互作用が失われるリスクも多大でしょうが・・） 　長文になりそうなので一度ここで投稿します。 案ずるより産むが易し！Try & Error！という意図のコメントだけは勘弁してくださいね。その通りです・・としか返信できませんので。また、私抜きで話を進めて下さっても結構ですので、遠慮なくコメントの程よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.569-8 - 2012/05/30 (水) 11:25:14 - よこから > 「non-porousのビーズであることと、遠心操作が不要であることが非特異をさげている」というメーカーの主張にはある程度納得もいくので、これで解決にしたいと思います。 補足になりますが、PIERCE/Thermo Sciでも遠心法だとcytoskeletal proteinが落ちるのでマグネットを使用した方がいいと言っています。（下記のP7１行目からと文献7を参照） www.proteinguru.com/protocols/IP%20guide2.pdf

(無題) 削除/引用 No.569-7 - 2012/05/30 (水) 09:21:51 - 挽きたて しゃしゃり出てきました。お答えしなかったのは、皆様のお答えに納得できたためです。 磁気ビーズでも非特異結合は０ではない原因には、思い当たるところがあります。 表面の性質：疎水性表面のものはブロッキング処理しても、親水性のものと比べて非特異結合が多い経験があります。親水性のものでも、その性質で非特異結合物の量・質が違うようです（同じ商品でないので他の性質・粒径・基材の違いが原因かもしれません）。 抗体：抗体医薬は(部分)変性抗体を徹底的に取り除いています。言い換えれば研究用抗体にはそれなりの比率(数%?)で(部分)変性抗体が含まれていますので、非特異的結合の原因になりえます。 抗体に特異的に結合するタンパク等を介した非特異的？結合もありそうです。 また、ビーズのブロッキング処理よりも検体・試料にブロッキング剤を微量添加する方が非特異的結合が少ない印象があります（経験が少ないため確かではありません）。

(無題) 削除/引用 No.569-6 - 2012/05/30 (水) 00:00:02 - op 頭ごなしに否定する人がいるから、それは無理だろうね。誰も関わりたくないんだろうね。

(無題) 削除/引用 No.569-5 - 2012/05/29 (火) 21:59:57 - Dakogilent dy様　ありがとうございます。 「non-porousのビーズであることと、遠心操作が不要であることが非特異をさげている」というメーカーの主張にはある程度納得もいくので、これで解決にしたいと思います。 トピックＮｏ．0553に投稿されている方々から意見を頂けなかったことが悔やまれます。　実際にDynabeadsを使っても、非特異がある程度は発生するという事実を以って、その原因について皆様といろいろ意見を交わせれば良かったのですが・・・・。

(無題) 削除/引用 No.569-4 - 2012/05/28 (月) 14:18:30 - dy 販売元では下のように説明していますが、いかがでしょうか？ >Sepharose(/agarose)では、長いインキュベーションが必要なことが多く、これは本質的にバックグラウンド結合の増大につながる。さらに、多孔性のSepharose(/agarose) の遠心分離ではゼラチン状のペレットがチューブの底に残り、ここに不要なタンパク質が捕捉されると測定値に誤差が生じ、バックグラウンドが増大する可能性がある。 >不要なタンパク質が多孔性のSepharose® ビーズの内部やビーズ間に捕捉されるコンタミネーションおよびバックグラウンドシグナルの増大を回避するためには充分な洗浄を必要とする。 www.veritastk.co.jp/attached/3285/Dynabeads_Vol1_1109.pdf

(無題) 削除/引用 No.569-3 - 2012/05/27 (日) 18:51:24 - Dakogilent 　ありがとございます。 粒径が小さいと・・・・・数を入れると表面積は膨大になってしまうし　・・・・違うかー・・・・曲率が高くて平面にならない？ってほど小さくもないマイクロオーダーだし・・・・ 　op様、申し訳ありません。粒径が小さいと非特異が下がるというロジックがわかりません。説明頂けますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.569-2 - 2012/05/26 (土) 22:29:57 - op 粒が小さいから。

免沈担体の非特異 削除/引用 No.569-1 - 2012/05/26 (土) 14:48:50 - Dakogilent Dynabeadsは非特異が少ないと言われていますが、なぜでしょうか？ 磁気ビーズは洗浄液の吸引除去が完璧で、取り残しが少ないから？ （だったら、磁気アガロースでも非特異は下がりますか？） Dynabeadsの表面が糖ではないからですか？ （だったら、アクリル系の担体で免沈したら非特異は下がりますか？） （糖担体への非特異タンパク吸着はそんなに多いのですか？） 遠心操作により、少なからず担体と一緒にタンパク質が沈殿するからですか？（スピンカラムのようなフィルター上で遠心すれば綺麗になりますか？） Dynabeadsはnon-porousだから？ （アガロース系はporousで、隙間のタンパク質が洗い流しにくいの？） Dynabeadsは綺麗ですという宣伝文句に踊らされているの？ （実際に綺麗になったという方もおられるので、嘘ではないでしょうが、 綺麗になる理由がそこには存在しないので） Dynabeadsを否定するつもりはございません。また、Dynabeadsと表記しているのは磁気ビーズの代表として表記したものであり、DYNAL社に対して特に悪意は無いことも追記しておきます。 免沈のトピックに付いて行けず、別トピックを立てさせていただきました。

全9件 ( 1 〜 9 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---