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Gibson assemblyと制限酵素でのクローニング 削除/引用 No.5654-7 - 2017/01/08 (日) 08:34:18 - 魚の子 皆様 貴重なご意見有難うございました！ 大変参考になりました。 自分でも詳しい方達に聞いて回ったところ、制限酵素の方がより多くのライブラリーを得られる感触があるそうです。 Gibsonの方は実験者の腕によらず、お手軽？なところが良いみたいですね。 制限酵素で試してみたいと思います。 有難うございました！！ 魚の子（ぽにょ）

(無題) 削除/引用 No.5654-6 - 2017/01/06 (金) 14:06:02 - おお 両方やってみるっていうのはどうだ。それで両方それなりに満足行く程度以上あれば両方使えば、片方で方法的に落ちたやつはもう一方で拾えるかもしれないし、運悪く片方だめでももう一方がうまく言ってたらそれを使えばいいわけだし・

(無題) 削除/引用 No.5654-5 - 2017/01/06 (金) 12:54:43 - AA Gibsonにしろ、In-fusionにしろ、NEBuilderにしろ、 制限酵素配列に依存しないライゲーションが行えることが 一番の売りだと思います。 実際に使用した感じだと、制限酵素でやるほうが ライゲーション効率は高いように思います。

(無題) 削除/引用 No.5654-4 - 2017/01/06 (金) 10:49:41 - mon Gibson assemblyは使ったことはなくて、In-Fusion kit（ver2)とNEBuilder HiFi DNA Assembly kitsの数少ない経験からは、使用したDNA量から想定すると「得られるコロニーが少ないな」という印象です。 もっとも同じ断片で通常法と比較したわけではないので使ったinsert DNAの性質（配列)のせいかもしれませんし、手技が下手なのかも。 10^4種くらいのレパートリーのライブラリーならお手軽だけど、10^5以上だと費用的にキツいなと。 phi29 DNA Polymeraseによる連結環状化DNA増幅（＞制限酵素処理＝直鎖化＞再連結）と組み合わせればなんとかなるかも。。 Gibson assembly試薬を自作すれば良いのか。。

(無題) 削除/引用 No.5654-3 - 2017/01/06 (金) 10:00:52 - AP libraryいっても色いろあると思うんですが、ターゲットはなんでしょうか。 genome, cDNA? どのように取得調製したもの？　insert sizeの範囲は？　 使用目的はcloning, Two-hybridやexpression screening, NGS? 主にクローニングのためにlibraryが盛んに作られていたころにはPCRもGibson assemblyもなかったんで、 逆に、今はNGSなど新手法のためのlibrary作りは盛んだけど、古典的なlibraryの需要はなくて、 同じ目的で両方の手法をやって比べられるという環境にある人はいないんじゃないでしょうか。ligase independentの方がメリットがあるかどうかは、やっぱり材料や目的によると思うんです。 in-fusionでlibraryを作るキットが売られていたり、Gibson assembly でlibraryを構築する手法の論文が出ていたり（検索したら見つかりますよね）、手法としてはありなんでしょうけれど。 論文なんかではどう言ってるんでしょうね。 ひとつ言えるのは、in-fusionにしてもGibson assemblyにしてもPCRの過程を含むので、インサートサイズに制限がある、制限を掛ける必要がある、とかインサートサイズや配列によってバイアスがかかる可能性がある、なので目的や材料に制約があるだろうという懸念はあります。

(無題) 削除/引用 No.5654-2 - 2017/01/06 (金) 09:57:07 - み Gibsonの方は限られた条件でしか経験がないのですが、 こちらはステップが少ないし、人の腕などにあまり影響されずにキットがもつ能力に応じた結果が得られるんじゃないですか。 しかしインサートが長いと入らないとかそもそも適応範囲が制限される可能性を考えます。 いっぽう制限酵素の方は大いに人の腕に依存して結果（効率）が変動しますよね。上手い人なら制限酵素でやった方が変な制限に縛られない気がしますが。。。 他の人のコメントを見てみたい。

Gibson assemblyと制限酵素でのクローニング 削除/引用 No.5654-1 - 2017/01/06 (金) 07:35:15 - 魚の子 お世話になっております。 現在、遺伝子ライブラリーを作製中なのですが、 ふと疑問に思ったことを質問させて頂きます。 インサートDNAライブラリーをプラスミドDNAに挿入する際は、Gibson assemblyと制限酵素処理によるライゲーションはどちらの方が効率が良いのでしょうか？ 出来る限り多種類の遺伝子ライブラリーを得たいと考えております。 どなたか詳しい方がいらっしゃましたら教えて頂けると大変助かります。 どうぞ宜しくお願い致します。 魚の子

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