全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.5641-7 - 2016/12/27 (火) 18:29:39 - ふで > 二重鎖間を固定してクロスリンクすることは少なくともこの条件では出来ないですよ。70%フォルムアミド、75℃ならdeprobingでも使われるような条件ですから、プローブが剥がれても全然不思議じゃない。第一、同じ方法で固定した細胞の二重鎖DNAを変性して一本鎖に出来てるんですもの。固定によって標識抗体が組織とクロスリンクを期待するならともかく。 単純にRNAに結合したDNAプローブがdenatureによって剥がれてしまったという解釈でよろしいでしょうか？もしそうであれば今後どのような展開に持っていけばいいですか？ denatureの時間を5min,10minと振りましたがDNAFISHのシグナルが同じぐらい強く出ていたので完全にdenatureが完了しているのだと考えています。 一応自分で考えている案としては、denatureの温度、時間を細かく振って同時に検出できる最適な条件を探していくという考えを持っています。

(無題) 削除/引用 No.5641-6 - 2016/12/27 (火) 18:26:00 - ふで > 赤、緑って色素としてはなんですか？　どうやって抗体についてるの（どこの製品かわかれば十分だけど）。 緑はFITC(anti-dig-fragment:Roche) 赤はストレプトアビジン549(ベクター)を用いています。 多分Nickで標識されたハプテンにモノクロorポリクロで結合しているものだと認識しています。 > その変性方法ならRNAはやられないと思うので（RNA単独でのISHは成功しているということなので、変性処理しても検出できるかどうかを試して）、同時ハイブリ、検出というのも可能なように思うけど、分けてやらないとだめなの？ すみません同時に検出する方法を知りませんでした。denatureを行った後、RNAFISH用プローブとDNAFISH用プローブを同時にハイブリするという解釈でよろしいでしょうか？ > RNAプローブではなくて、RNAを検出するためのDNAプローブということですよね。 申し訳ありませんRNAFISH検出用のDNAプローブです。

(無題) 削除/引用 No.5641-5 - 2016/12/27 (火) 17:17:05 - AP >個人的には、denatureの条件が強すぎるため、RNAにクロスリンクしたプローブが外れてしまったのかと思っています。そんなことが実際あるのでしょうか？(約75℃ 5min 10minでdenatureをしたサンプルでRNAのシグナルがなくなってしまいました。) 二重鎖間を固定してクロスリンクすることは少なくともこの条件では出来ないですよ。70%フォルムアミド、75℃ならdeprobingでも使われるような条件ですから、プローブが剥がれても全然不思議じゃない。第一、同じ方法で固定した細胞の二重鎖DNAを変性して一本鎖に出来てるんですもの。固定によって標識抗体が組織とクロスリンクを期待するならともかく。

(無題) 削除/引用 No.5641-4 - 2016/12/27 (火) 17:02:15 - AP 赤、緑って色素としてはなんですか？　どうやって抗体についてるの（どこの製品かわかれば十分だけど）。 その変性方法ならRNAはやられないと思うので（RNA単独でのISHは成功しているということなので、変性処理しても検出できるかどうかを試して）、同時ハイブリ、検出というのも可能なように思うけど、分けてやらないとだめなの？ >RNAプローブは長さ2.5kbpでnick translationにてビオチンで標識 RNAプローブではなくて、RNAを検出するためのDNAプローブということですよね。 DNAプローブ同士ならハイブリの条件も合わせやすいとおもうけど。

(無題) 削除/引用 No.5641-3 - 2016/12/27 (火) 16:50:52 - ふで すみません詳細な情報を追加いたします。 RNAプローブは長さ2.5kbpでnick translationにてビオチンで標識 DNAプローブは長さ160kbp(BAC)でnick translationにてジゴキシゲニンで標識しています。 検出は全てアンチビオチン(ストレプトアビジン)、アンチジゴキシゲニン抗体にてビオチンを赤、ジゴキシゲニンを緑で検出しています。 具体的なプロトコルとしては カバーで培養した細胞を膜透過処理→4%PFA 10minで固定→RNAプローブ ハイブリダイゼーション over night→ビオチンの2次抗体を撒いて検出→4%PFA 10minでRNAシグナルを固定→75℃の70%ホルムアミド/2×SSC　5min or 10minでdenature→DNAプローブ ハイブリダイゼーション over night→ジゴキシゲニンの2次抗体を撒いて検出→DAPIで染色→封入 の手順を踏んでいます。書いてはいませんがリンスを念入りに行っています。 ハイブリダイゼーションは標識したプローブをパラフィルムに載せその上に細胞が載ってるカバーをマウントしています。 稚拙な情報で申し訳ありません。他に必要な情報がありましたら何でも聞いてください。

(無題) 削除/引用 No.5641-2 - 2016/12/27 (火) 16:21:06 - AP 最近、その手の実験から離れているのでトレンドな手法に疎いのだが、それでもやっぱりいろいろバリエーションがあるとおもうんだなあ。どうやっているのかもうちょっと詳細を教えてくれんかの。 ・FISHの標識は何？　プローブに直接標識するの？　それとも抗原抗体、アビジンビオチンなどを介して間接的に標識するの？　あるいは酵素などでエンハンスしてる？ ・プローブの属性について情報を（DNA/RNA? 長さ?　標識方法？　etc.） ・75℃でdenatureというけど溶媒はなに？ 核酸の二重鎖それ自体はPFA固定してもそれ自体はクロスリンクしないと思うな。 Formaldehyde gel EPはRNAの変性状態を保つために使ったりするし。

RNA/DNAFISH同時検出法のプロトコル 削除/引用 No.5641-1 - 2016/12/27 (火) 15:14:32 - ふで いつもお世話になっております。 現在ヒト培養細胞を用いて、RNA/DNAFISH同時検出法を確立させようと思っています。 現時点で、4%PFA 10min固定後のサンプルを作成し non denatureでRNA FISHの検出 denature有でDNA FISHの検出を単独に行う事は出来ています。 しかし、RNA FISHを完全に終わったサンプルをもう一度4% PFA 10minで固定した後denatureしてDNA FISHを行うと、DNA FISHのシグナルはとても強く出ていますがRNA FISHのシグナルが消えてしまいます。 個人的には、denatureの条件が強すぎるため、RNAにクロスリンクしたプローブが外れてしまったのかと思っています。そんなことが実際あるのでしょうか？(約75℃ 5min 10minでdenatureをしたサンプルでRNAのシグナルがなくなってしまいました。) この事情についてご存知の方ご教授お願いいたします。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---