SYBR GREENを用いたリアルタイムPCRを行っています。
ある遺伝子についてプライマーセットを検討しているのですが、
この遺伝子のイントロンが長くても500bp程度なのです。
より短いイントロンを挟んだプライマーセットではゲノム由来の産物が増えてしまいました。
そこで、500bp程度のイントロンを挟んだプライマーを作ってみようと思っています
しかし、今回の遺伝子の場合、イントロンが500bp程度、目的の産物が150bp程度だとすると、
ゲノム由来の産物が650bp程度なのでこちらも増幅されてしまいそうな気がするのです。
みなさまのご経験で、リアルタイムPCRでは650bpというのは増幅されてきますか？
プライマーを作ってPCRをかけてみろと言われそうですが、貧乏なラボなので、難しいのが現状です。
元のサンプルが非常に微量なRNAであること、発現量が低いターゲットであることが原因なのか、DNase処理してもゲノム由来が増えてきてしまいます。
二つのエクソンにわたるプライマーも考えたのですが、スプライシングバリアントがあって設計しづらいです。
わかりにくい文章で申し訳ありませんが、このような設計しづらい場合の対処法など教えていただけたら大変ありがたいです。 |
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