BioTechnicalフォーラム [低分子ペプチド(1kDa)の分離]

低分子ペプチド(1kDa)の分離

No.5635-TOPIC - 2016/12/23 (金) 02:29:32 - マックス

こんにちは。
現在、低分子ペプチド(1kDa)の分離をtricine-PAGEを用いて行っています。
1kDaのペプチドと2kDaのジペプチドを分離したいのですが、分離どころかバンドすら検出できていません。
そこでお尋ねしたいのが、tricine-PAGEの他に良い低分子の分離方法があるでしょうか。
よろしくお願いいたします。
　

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No.5635-10 - 2016/12/25 (日) 16:33:44 - toto

検出したいだけであれば、確かにtris-tricineSDSPAGEが選択肢と思いますが、そのサイズだと工夫が必要になります。他の方の書かれているとおりに染色液につけておくと拡散してバンドにならなくなるので、一つの手は、脱色液のメタノールを50%にすることで、そうするとゲルがかなり縮むので、もれを防ぐことができます。CBBでも大抵は染まりますが見えなければ、シルバー染色のほうが無難かもしれません。ものが十分な量があり、生体からの粗抽出などでなく、低分子のものだけのものならば逆相のHOLCがあれば、それでやったほうが早いし簡単ですが。

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No.5635-9 - 2016/12/25 (日) 14:19:48 - 1234567

10KDa以下になると易動度にアミノ酸組成の影響（特にチャージをもつアミノ酸）が強く現れてくるので、理論的分子量に一致した分子量位置に来るかどうか分からないので、このようなペプチドの場合、電気泳動上での分子量はあまりあてにならないような気がします。たとえば分子量50000のペプチドが分子量20000のペプチドよりも下にバンドがでるとかもありえるかもしれないし、なので1Kと2Kの分離は技術的にも結果の解釈の上でも難しいようなきがします。

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No.5635-8 - 2016/12/24 (土) 10:15:39 - CBB

CBBは芳香性側鎖やアルカリ性側鎖に結合するといわれているので、ポリペプチド鎖がそれらのアミノ酸をもっていないと染色できないのではないでしょうか。1kDaと2.5kDaのポリペプチドなので、だいたい10とか25くらいのアミノ酸くらいかと。CBBで染まる十分なアミノ酸が含まれているとか、先攻研究でCBBで染めていたなら問題ないと思います。
ちなみに、調べてみれば1.5kDaくらいでもtris-tricineで見ているものもあるので、分離自体は原理的に不可能というわけではないと思います。

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No.5635-7 - 2016/12/23 (金) 23:33:26 - 1qw23et6y7u8i9o0-

1~2KDaだと小さすぎてフロントラインに集まったり、染色脱色中に容易に拡散してしまいゲル電気泳動で分離分析する対象ではないので、逆相HPLC等による分離が適切とおもいます。

＞＞CBBさん

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No.5635-6 - 2016/12/23 (金) 15:54:17 - マックス

とりあえずCBB染色をしているのですが、適していない方法でしょうか？
短いペプチドに適した方法があればお教えください。

＞＞おおさん

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No.5635-5 - 2016/12/23 (金) 15:52:44 - マックス

ありがとうございました。
カラムの種類も含め、検討してみます。