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IgG抗体の酸性変性後に中性に戻した場合、結合能は改善するか。 トピック削除
No.5631-TOPIC - 2016/12/20 (火) 19:07:36 - TE
あるタンパク質に結合するIgG抗体を磁気ビーズにカップリングさせて、免疫沈降を行っております。最後の溶出はGlycine-HCl buffer(pH2.8)で行っています。Glycine-HCl bufferにてIgG抗体は変性してしまうと思いますが、PBSなどで中性(pH7.4)に戻すと結合能が回復するなんてこと、ありますかね。

抗体なら結構安定しているので、pH戻せば結合能は回復するのではないかと思いました（貧乏研究者のため、再利用を検討しています）。

ご経験ある先輩方、ご意見いただけると幸いです。
　
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No.5631-7 - 2016/12/22 (木) 08:00:46 - TE
皆様、ご意見ありがとうございます。

まとめますと、
１）IgG抗体は比較的安定だが（特にポリクローナル抗体）、抗体によっては酸性変性によって結合能を失う可能性がある。
２）（可及的速やかに）pHを元に戻すことで再利用可能かもしれないが、回数に限度がある。

使っている抗体で何回くらい再利用できるかを検討してみます。
ありがとうございました。

この掲示板素晴らしいですね。

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No.5631-6 - 2016/12/21 (水) 10:38:59 - toto
抗体カラムからの溶出では良く使われる方法です。毎回カップリングしてると破産します。もともと抗体はS-Sのために立体構造が安定ですが、固相に結合してるためにさらに安定になっているようです。大抵の抗体、特にポリクロならまず確実にこの方法で使えます。モノクロでもほとんど大丈夫でしたが、たまに死んでしまうものもあります。

さらに長生きさせたい場合はPIERCEから出ているGentle Ag/Ab Elution Buffer, pH 6.6というが便利です。ただhigh saltなので、電気泳動にはそのまま使えません。

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No.5631-5 - 2016/12/21 (水) 02:46:16 - おお
酸で溶出してpHを戻して再生するのは一般的に抗体ではよくやられる方法です。ただし何回もやると流石にヘタってくるものも結構あるのではないかと。

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No.5631-4 - 2016/12/20 (火) 20:20:09 - AP
抗原固相化カラムを用いた、「抗体」のアフィニティー精製はまさに、それくらいのpHのGlycine bufferで溶出するのが第一選択です（抗原抗体反応によってアルカリ溶出とかマグネシウムや変性剤などで溶出するほうがいい場合もあるらしい）。それで抗体が不可逆的にだめになるならありえないでしょう。
溶出液はpH 8程度の高濃度のTris bufferに落としていって即中和するのがよくやる方法です。

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No.5631-3 - 2016/12/20 (火) 20:06:43 - １２３４５６７８９０
回復します。蛋白質のなかではIgGは比較的丈夫なほうです。再利用できます。ただ反復するとだんだん失活してくるので、限度はありますが、すくなくとも１回は大丈夫とおもいます。

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No.5631-2 - 2016/12/20 (火) 19:21:26 - tracker
抗体精製時にはProteinGから抗体を酸溶出させたりする場合もあるし
リブロットの際に酸性バッファーを用いても抗体によっては割とがっつり保持されているものもあるので
抗体によっては酸性に暴露しても結合能が保持されたり中性付近でリカバリーしたりするのでは？

IgG抗体の酸性変性後に中性に戻した場合、結合能は改善するか。 削除/引用
No.5631-1 - 2016/12/20 (火) 19:07:36 - TE
あるタンパク質に結合するIgG抗体を磁気ビーズにカップリングさせて、免疫沈降を行っております。最後の溶出はGlycine-HCl buffer(pH2.8)で行っています。Glycine-HCl bufferにてIgG抗体は変性してしまうと思いますが、PBSなどで中性(pH7.4)に戻すと結合能が回復するなんてこと、ありますかね。

抗体なら結構安定しているので、pH戻せば結合能は回復するのではないかと思いました（貧乏研究者のため、再利用を検討しています）。

ご経験ある先輩方、ご意見いただけると幸いです。
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