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(無題) 削除/引用 No.5626-15 - 2017/01/12 (木) 02:01:25 - おお LoD is defined as “The lowest amount of analyte in a sample that can be detected with (stated) probability, although perhaps not quantified as an exact value.” In molecular diagnostics we commonly report results and make conclusions at a confidence of 95%. Using this as criteria, we can calculate the theoretical limit of detection (LoD) by qPCR due to sampling ambiguity, i.e., when analyzing a subset of the total sample. This is the lowest concentration that leads to at least 95% of the sample replicates being positive; hence, at this concentration the risk for a false negative result shall be less than 5%. This turns out to be 3 molecules per reaction volume for the IntelliQube. F http://www.douglasscientific.com/Content/pdfs/AppNotes/IQAPP-PCR-Sensitivity.pdf ３コピーの理論根拠はこれのようです。Reaction tubeに１コピーぐらいになる溶液では、あるチューブはポジに出て他のチューブはネガにでるため、ポジ、ネガの判定を一つのチューブでするのには向かないのが理由のようです。 かといってReaction tubeに１コピーあった場合増えないわけではなく、優れたパフォーマンスのqPCRのばあいCt値はバックグランドより優位に低い値がでるため、検出できることは確かです。実際にこれくらい低いコピー数になると数十のReaction tubeをつくって同時にqPCRをするという手はとれます。

(無題) 削除/引用 No.5626-14 - 2017/01/11 (水) 17:23:29 - おお http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2013/January/qPCR-Single-copy-targets/biotechniques-339005.html If your targets are rare, especially approaching single copy entities in your samples, the lowest Ct you can expect is 33.219, assuming that the level of sensitivity of the qPCR machine is 10 billion copies at threshold (as it is with most qPCR machines). After 33.219 cycles, one copy of the template will become 10 billion copies, meeting the threshold if the reaction performs at 100% efficiency. http://www.techne.com/adminimages/A08_005A_Detecting_low_copy_number(1).pdf

(無題) 削除/引用 No.5626-13 - 2017/01/11 (水) 16:23:06 - おお いや別に否定するとかの問題じゃなくって理想的な状況を設定してだいたいそれぐらいだったという話で、検証線引いて４５サイクルまできれいに引けるならその系ではそこまで見れるってことで何ら否定するつもりはないですよ。

(無題) 削除/引用 No.5626-12 - 2017/01/11 (水) 13:46:45 - IHC? おおさん ddPCRとの単純比較はできない。というのは分かりますが、もともとが原理から単純計算したらこうなるという話ですので。。。 ところで、 ＞３５サイクルは私が計算した理想的な状態での理論値です について教えて頂きたいのですが 3コピーはMIQEが書いていることなので根拠文献があると思います（読んでませんが） 理論上それがqPCRのLODです あと実際普段測定しているPrimer Probe Setで濃度既知の検量線引いたときに切片が45とかふつーにあると思うのですが、おおさんの理屈だと「ここがせめて35付近にないとおかしい」という話になります。 それだとこの世界で出回っているほとんどの研究成果を否定できてしまうのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5626-11 - 2016/12/27 (火) 05:31:40 - おお >分割する前の20µL中の鋳型DNAは2万倍の2万コピーあればCq値35で出てくることになります。 それは変ではないですか、２０ulの溶液で３５サイクル回したとき、ポジのDroplet一個の２万倍のシグナルが出てることになります。そんなに検出感度が違いますか？ 検出システム(感度)や溶液の最適化などで違いがあるとするなら単純比較は難しいのでは。 ＞理論上3コピーまで測定できる １コピーでは検出できないという理論があるのですか？そういう理論は想像できませんけど。。。なぜddPCRにした途端１コピーがみれるのでしょうか。 ３５サイクルは私が計算した理想的な状態での理論値です。でこの数字は一応世間に出回っているようです。もちろんプラクティカルにはブレると思うので（DNAの色素との配列依存的親和性、使っている色素の感度、いろいろな要因があるでしょうけどRTをしているならcDNAの状態からPCRがかかる効率であるとかも考慮に入れたほうがいいのかもしれません）、実際にある実例で４０サイクルであったりしても変だとは言いません。

(無題) 削除/引用 No.5626-10 - 2016/12/26 (月) 22:07:15 - GEX 勘違いしていましたが、ddPCR＝Digital Droplets PCRなんですね。 delta-delta PCRの略で従来のqPCRの話しかと思ってました。 RT-PCRとreal-time PCRといい、また紛らわしい名称が増えた... Roche社の試薬を使われているんですね。 やはり本家のモノは性能がいいんでしょうか。 run間の差はやはり35cycleを超えると2-3cycleはぶれてしまいます。 volumeは20ulでおこなっていましたが、試薬の変更とvolume upも試してみたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5626-9 - 2016/12/26 (月) 12:30:43 - IHC? おおさん 1コピーのものが分割した2万Dropletsのうちの一か所で検出されCq値が35だったとします。 そうすると、分割する前の20µL中の鋳型DNAは2万倍の2万コピーあればCq値35で出てくることになります。逆に言うと同じ1コピーのものをqPCRで測定すればCq値35よりHigh Cqの2万分の1にあたる部分で出てくるはずです（=でない）。 ちなみにMIQEには理論上3コピーまで測定できると記載されていたように思います（元論文読んでないけど）。つまりqPCRの感度はあげたところで3コピーまでで、それ以下は測定限界を超える（=NoCq）という感じです GEXさん Cq=35以降は信頼性が薄いというのはSYBR法でよく言われている基準で、Taqman法ではPrimer Setにもよりますが、40-45までダイナミックレンジが広がるというのは、そう言えば羊土社あたりの参考書でも昔見た覚えがあります 結局Primer Probe Set次第なんですが、私は毎回50回して、結局、45まで検量線が引けていても、最悪43くらいまでしか採用しません。 （事情によっては45手前を採用したことはあります） 測定サンプルは普段一定に希釈するので、希釈倍率を落とした再測定サンプルを作り、再度測定すればいいので

(無題) 削除/引用 No.5626-8 - 2016/12/26 (月) 11:44:39 - おお >それを考えると普段やってるPCR反応のCq=35ってたぶん1コピーではないだろうな、となんとなくお分かりになるかなと いや、わからないのです。。。

(無題) 削除/引用 No.5626-7 - 2016/12/26 (月) 09:44:01 - IHC? >おおさん >ddPCRはたとえば１０コピーある溶液から１００Dropletsつくったとして、１０個がポジというようなやり方ですよね。でたしか４０ー４５サイクル回していたかと。 そうです。ということは、1コピー/Dropletの1Dropretの中にある鋳型DNAはとても高濃度ということになります（今回の場合100に分けた例なので100倍です。たしかBioradは2万くらいに分割=2万倍の感度ではなかったでしょうか）。 それをPCR酵素が非特異を起こさない反応回数まで回すのですから検出できます。要するに反応液中にコピー数が少量しかなかったとしても分割して高濃度部分の割合を見るので問題ないという考えです それを考えると普段やってるPCR反応のCq=35ってたぶん1コピーではないだろうな、となんとなくお分かりになるかなと （ddPCRとqPCRの相関とか見てる論文見れば具体的な数値が言えるでしょう） >GEXさん >Cq値3-5のブレ はアウトですね。機器自体のRun間の差はどれくらいあるのでしょうか？ 使っているのはRocheのTaqman（ROX補正有）、それからUPL Probeです 手元のPrimer Setを見ても、Cq=45を超えるくらいまで検量線がきれいに引けているPrimer Setはかなり多くあり、それほど難しいとは思いません。 UPL Probeはものによっては蛍光が悪いので、そこの当たり外れは大きいと感じます 私が使っている機器は安物なので、お金があるならRocheをおすすめしますが、機器が安物でもいいPrimer Setが作れれば行けるなという実感です あと反応系が10μLということはないですよね？ バラつきを低減されたい場合、反応系を50µLにするのも手です。 あとは、シールをしているのなら、蒸発がないか反応後の溶液量を測ってみることをお勧めします

(無題) 削除/引用 No.5626-6 - 2016/12/23 (金) 02:06:43 - おお 済になっていますがこの場を借りてすこしDiscussionさせていただきませんでしょうか。 >大体Ct値が35あたりから定量値がぶれ始めて コピー数が少なくなってきてますから、チューブに入っているコピー数の違いが大きくCt値に影響してくるんでしょうね(もしバックグランドの影響がないとしたなら)。 >とりあえず「1コピーがCq=35」という認識はたぶん間違いでしょう >（ddPCRの概念と合いません） ddPCRの概念と合わないというところをどなたか教えていただけませんでしょうか、、、 ddPCRはたとえば１０コピーある溶液から１００Dropletsつくったとして、１０個がポジというようなやり方ですよね。でたしか４０ー４５サイクル回していたかと。

(無題) 削除/引用 No.5626-5 - 2016/12/22 (木) 23:39:19 - GEX >[Re:3] IHC?さんは書きました : > 最近の酵素と修飾核酸を用いるTaqman法ではCq=45まできれいに検量線を引けたことがあります（NoRTは200倍以上濃いcDNAまで毎回確認していますが完全に0です） よければ、Taqmanの試薬とマシン名を教えてもらえませんか？ 当方、ABI社のGene Expression AssayとGexe expression Master mix, マシンは StepOneでおこなっていますが、大体Ct値が35あたりから定量値がぶれ始めて 45あたりでは同じサンプルでも3-5は違ってしまいます。 良い試薬があれば検討したいので、宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.5626-4 - 2016/12/22 (木) 13:31:54 - kick the leg コメントいただきありがとうございました。 参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.5626-3 - 2016/12/22 (木) 12:41:39 - IHC? はっきり言って測定系の感度・特異度によります 最近の酵素と修飾核酸を用いるTaqman法ではCq=45まできれいに検量線を引けたことがあります（NoRTは200倍以上濃いcDNAまで毎回確認していますが完全に0です） SYBR法なら確かにCq=35までしか信用できないと昔言われていましたが、今もそうなのかな？ とりあえず「1コピーがCq=35」という認識はたぶん間違いでしょう （ddPCRの概念と合いません） PCRの場合は特異度を強く確保できれば感度がかなりあがると思います

(無題) 削除/引用 No.5626-2 - 2016/12/18 (日) 05:21:06 - おお それぞれの実験で実際の許容範囲は変わってくるだろうから、プラクティカルベースで決めればどうでしょうか。

定量PCRにおける定量性のあるCp値について 削除/引用 No.5626-1 - 2016/12/17 (土) 22:07:54 - kick the leg 極めて初歩的な質問でお恥ずかしい限りです。 一般的にリアルタイムPCRにおけるCp値はどのあたりまで信頼できると 考えればよいのでしょうか？以前、1コピーが増幅するのが35サイクル あたりなので、それ以上のCp値は信頼性に乏しいと教わったことがあり ました。 MIQEガイドラインでは40との記載がありましたが、大きすぎるかと思い ました。どなたかこのあたりが記載されている論文をご存知の人がおられ ましたらどうぞご教示ください。 以上、よろしくお願い申し上げます。

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