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vectorに目的配列を入れると大腸菌が増えない トピック削除
No.5617-TOPIC - 2016/12/15 (木) 21:17:24 - Gi
mammalian expression vector（retrovirus expression vector）に目的遺伝子を入れると大腸菌が増えない問題に直面し困っています。
そもそも初めにcloning vectorに入れるのに難儀しました。出てきたコロニーから取れたプラスミドは理屈ではありえないdeletion, insertion (1 bp〜15 bp)がフレームシフトの形で入ったものばかりで、24時間以上置いたアガープレートに遅れて出てきた極小コロニーを拾ったものからやっと一つ正しい配列のクローンが取れました。
その後、このcloning vectorから目的遺伝子部位を制限酵素（BamHI/XhoI）で切り出し、retrovirus expression vectorにligationしようとしたのですが、コロニーの出現頻度はとても低く、それらはみなself-ligationなどの別ものばかりでした。長時間培養して後から出てて来る小さなコロニーを拾っても、あたりはありませんでした。インサートが悪さをしているようです。
cloning vectorはそもそもpromoterがありませんし、mammalian expression vectorのpromoter（レトロウイルスのLTR promoter）は大腸菌では働かないはずです。このようなことはどうして起こるのでしょうか？また対処法はあるのでしょうか？
アドバイス、よろしくお願い致します。
　
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No.5617-4 - 2016/12/15 (木) 23:44:31 - おお
よく大腸菌で働くSD配列に類似する配列などがあってそこから遺伝子産物ができてしまうんじゃないかというスペキュレーションをすることがあるとおもいます。

低温（室温から３０度ぐらい）、低濃度抗生物質（大腸菌選択用）で大腸菌ないのプラスミドコピー数を減らして、プラスミドからの影響を抑えるとポジの率が上がることがよくあります。

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No.5617-3 - 2016/12/15 (木) 22:07:15 - Gi
774Rさん、素早いレス、ありがとうございます。
温度を下げるといい可能性があるのですね。実は、最初に37℃でオーバーナイト、続いてさらに24時間くらい置いて出てきた小さなコロニーも全部はずれでした。その残りのプレートを室温のオートクレーブバックに廃棄していたのですが、先のミニプレップに当たりがないことが判明したところで（24時間くらい）気になり取り出してみると、さらに小さいコロニーが出ているのが確認できました。ちょうど今これら室温で出てきたコロニーを拾い37℃でミニプレップカルチャーを始めたところだったのですが、77Rさんの経験に従い30℃に温度を落としてみます。結果が出ましたらご報告させていただきます。

(無題) 削除/引用
No.5617-2 - 2016/12/15 (木) 21:34:15 - 774R
同様の経験あります。

こちらのケースが当てはまるか分かりませんが、37℃ではほとんど増殖せず、室温で24時間以上培養するとようやく小さなコロニーが出てきました。
液体培養も37℃ではプラスミドが消失し、30℃以下でようやく取れるようになりました。
菌株も数種類試したところ、わずかに改善が見られましたので、試す価値はあると思います。

プロモーターが無いのに不思議ですが、なんらかの配列のせいで微量に転写が起きてる可能性もありますし、プラスミドDNAの存在自体が毒性となってる可能性もあります。特定は難しいと思います。

vectorに目的配列を入れると大腸菌が増えない 削除/引用
No.5617-1 - 2016/12/15 (木) 21:17:24 - Gi
mammalian expression vector（retrovirus expression vector）に目的遺伝子を入れると大腸菌が増えない問題に直面し困っています。
そもそも初めにcloning vectorに入れるのに難儀しました。出てきたコロニーから取れたプラスミドは理屈ではありえないdeletion, insertion (1 bp〜15 bp)がフレームシフトの形で入ったものばかりで、24時間以上置いたアガープレートに遅れて出てきた極小コロニーを拾ったものからやっと一つ正しい配列のクローンが取れました。
その後、このcloning vectorから目的遺伝子部位を制限酵素（BamHI/XhoI）で切り出し、retrovirus expression vectorにligationしようとしたのですが、コロニーの出現頻度はとても低く、それらはみなself-ligationなどの別ものばかりでした。長時間培養して後から出てて来る小さなコロニーを拾っても、あたりはありませんでした。インサートが悪さをしているようです。
cloning vectorはそもそもpromoterがありませんし、mammalian expression vectorのpromoter（レトロウイルスのLTR promoter）は大腸菌では働かないはずです。このようなことはどうして起こるのでしょうか？また対処法はあるのでしょうか？
アドバイス、よろしくお願い致します。
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