OK。よくあるUb化蛋白質のpull-down assayだな。調べたい蛋白質に対する抗体でwesternして、それがUb化されているかどうか手っ取り早くみるやつな。すごい簡単だし、変性条件でやれるメリットはいろいろ大きいな。
ふつうのlysis bufferもいろいろあるけど、こーのーどニョソやSDSとかみたく変性剤をいっぱい含むlysis bufferだとあたりまえだけど抗体も変性失活しぃちゃうから、やっぱそのままでは無理だな。とーせきとかで変性剤ののーどをすごい下げるとかすればできるけど。にょそならとーせき除去OKだけど、SDSはなかなか除けないな。透析中に沈殿とか起きる事もあるし、うまくいくかどうかは不透明。だから、非イオン性界面活性剤入りのbufferで希釈して変性剤濃度がIPの抗原抗体反応に支障ないくらいまで薄めた方がむしろいいかも。
IPできるようなlysis buffer使えば、IP可能ないい抗体さえあれば理論的にはできるとおもうけど、IPにもつかえる抗polyUb抗体ってほんとにあるのかな？この抗体最強みたいな話聞かないけどな。非変性条件だと、NEMとかアイオードアセトアマドみたいなイソペプチダゼ阻害剤入れとかないと精製過程でどんどん脱Ub化が起きてしまうから入れたほうがいいよ。
tag-標的蛋白質でIP, ub抗体でウェスタンはあるよ。tagに対する抗体がIP可能ないい抗体かどうかそこが鍵だな。ただ、lysis bufferの組成とかにもよるけど。tag-標的蛋白質にくっついているような蛋白質もそれなりに一緒にco-IPされてくるからな。ウェスタンでみているシグナルが、そういう蛋白質で分子量が標的蛋白質と非常に近いUb化蛋白質と反応している可能性は排除できないから一応その辺は意識してやった方がいいな。 |
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