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(無題) 削除/引用 No.5607-30 - 2016/12/16 (金) 00:24:27 - IHC? ＞おおさん ピッタリくっつきやすいのは真ん中ですし確かにそうですね それなりに激しくふる時に端っことか折ったりしていれば10枚とかでも隙間ができて浸透あがりそうってふと思いました 蝋をちょっと垂らして一枚一枚にポッチを作っておくとか？ すいません、やったことはないので思いつきです

(無題) 削除/引用 No.5607-29 - 2016/12/15 (木) 23:35:34 - おお ムラができそうと思うのは、浸透しにくいなら浸透ムラがあるかもと思ったりするんです。例えば真ん中はバンドが弱くなって外側は検出感度が高いとか。

(無題) 削除/引用 No.5607-28 - 2016/12/15 (木) 22:36:17 - IHC? ＞おおさん WBは一年以上前にちょっとレアな蛋白をやったきりなので、染まりムラってのがよく想定できないんですが 私が言っている高感度ケミルミはダイナミックレンジがかなり広くなる感じという印象でした（抗体の特異性が良かっただけかもしれませんが） West Picoで3時間露光してやっと光る蛋白がfemtoだと可視できるほどにメンブレンが光焼けします笑 あれなら抗体の浸透とかホント関係ないだろうなって気がしてはいますが試したことはないですｗ FemtoではLC-MSベースのデータベースで殆ど存在しないと言われてるネガコン臓器でも5分露光で光ってしまったので、矯正発現系ポジコンのMockをネガコンにしました 逆に言うと高感度なFemtoで定量は無理そうだなって印象です

(無題) 削除/引用 No.5607-27 - 2016/12/15 (木) 06:41:28 - おお ありがとうございました。 ＞あと、仮にメンブレンがピッタリくっついて抗体が浸透しにくかったとしても最近売ってるかなり光るケミルミならそれでも綺麗に光るのでは？ 染まりにむらができていると嫌だなあって言う気がします。。。 いまアドバイスにある方法でやっていますが、今のところ良好です。

(無題) 削除/引用 No.5607-26 - 2016/12/14 (水) 21:55:11 - IHC? 水平ではなくフルタイプなら5枚までタプタプ泳がせたことはあります。 なんというか、最大の傾斜になった時にBoxの横にあたって、一枚一枚が何となく隙間できているような状態（それなりのスピードでふっている）であれば、ふつーの条件と変わらないし特に汚かった覚えもありません。 ただBoxの嵩が足らなくて、少しづつ漏れてて、次の日一次抗体液が回収したら減っていたので辞めました あと、仮にメンブレンがピッタリくっついて抗体が浸透しにくかったとしても最近売ってるかなり光るケミルミならそれでも綺麗に光るのでは？という気がします 最近やってないので覚えてないですけど、トランスファーしたメンブレンって一応平衡化B＋パックで保存できましたよね？ 時間に追われてなければ、2〜3枚ずつでいいのかなって思います。

(無題) 削除/引用 No.5607-25 - 2016/12/14 (水) 15:20:37 - おお ＞疎水クロマトグラフィーと クロマト的だという話は聞くことがありますね。

(無題) 削除/引用 No.5607-24 - 2016/12/14 (水) 15:16:34 - おお >トランスファーの条件ですらそんなにスカスカ通り抜けるもんじゃないのに、ブロックしているならさらに目詰まりしている 水分子が抗体を取り囲んでくついいているいると言う指摘も考慮すれば確かにかなり通りにくくなっているかもしれませんね。洗うときも何分間も振るということから、浸透してしまった抗体が放出されるにも時間がかかっているという見方もできるかなぁ、、、いやある程度の親和性なのかもしれませんけど。 ＞水分子やSDSが外れ SDSが剥がれるというのはよく記述にあるので覚えています。もしかしたらゲルから出るのをメタノールが助けているって書かれたものがあったような気もしてきましたが、しっかり思い出せないので空想かもしれません。。。移動しやすくなるということ自体は納得です。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5607-23 - 2016/12/13 (火) 20:08:08 - 中年 ブロッティングの際にはメンブレンは穴は大きくても表面積の大きい疎水クロマトグラフィーとして機能しているんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.5607-22 - 2016/12/13 (火) 19:22:34 - AP >[Re:20] おおさんは書きました : > そうなんですよ。実際スカスカと言える状態かわからないので、、、でも抗体反応のときはブロックなどしてますので吸着させるような条件でないしトランスファーで２枚目に写りにくいという状況とは違いますよね。 トランスファーの条件ですらそんなにスカスカ通り抜けるもんじゃないのに、ブロックしているならさらに目詰まりしている→トランスファの時より一層、通り抜けにくいということを言いたかったのです。 > MeOHが水を剥がすのがトランスファーで有効な効果があると言うのはもしそうだったら勉強になりました。よくわからないのですが別に実際にもっと大きな分子になっていてメンブレンにトラップされやすいならそれはそれでいいような気もするのですが、、、あ、ゲルから出すときに有効と言うことなんでしょうか？ 水分子が外れて移動しやすくなる。 水分子やSDSが外れてメンブレンとの疎水結合や静電相互作用が強くなり膜に吸着しやすくなる。 のが教科書的な説明だと思います。 まあ、コロイド溶液に塩やアルコールを加えると水和水がとれることでいろいろな現象が起こるというのは高校あたりでならったことで、タンパク質溶液はコロイドの代表ですから。

(無題) 削除/引用 No.5607-21 - 2016/12/13 (火) 19:11:01 - AP 話は変わるけど、 サザンブロットを重ねてハイブリしたら、一方の膜にブロットされた核酸がもう一方の膜に転写されて検出されたことがありました。結構、強固なimmobilizationしてたはずなんですけど（ポジティブチャージナイロン+アルカリトランスファ+UV照射）。

(無題) 削除/引用 No.5607-20 - 2016/12/13 (火) 18:35:08 - おお そうなんですよ。実際スカスカと言える状態かわからないので、、、でも抗体反応のときはブロックなどしてますので吸着させるような条件でないしトランスファーで２枚目に写りにくいという状況とは違いますよね。 MeOHが水を剥がすのがトランスファーで有効な効果があると言うのはもしそうだったら勉強になりました。よくわからないのですが別に実際にもっと大きな分子になっていてメンブレンにトラップされやすいならそれはそれでいいような気もするのですが、、、あ、ゲルから出すときに有効と言うことなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5607-19 - 2016/12/13 (火) 17:45:43 - AP >まあ膜は0.2umのポアサイズで抗体からしてみればスカスカとも言えるでしょう これはどうかな。 抗体も含めタンパク質は、ブロットできるつまりメンブレンにトラップされるんだし、重ねてブロットしたとき二枚目にも写るけど一枚目よりずっと薄い。性能の良いメンブレンほど吸着力が高くて二枚目には写りにくかったりする。安々とは通り抜けないわけです。 タンパク質は溶媒中では水分子なんかが配位していて実際の分子より嵩高くなっていますからね（トランスファにMeOHを入れる理由のひとつが水分子を引き剥がすことだったかと）、メンブレンポアを自由拡散できるようなシロモノではないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5607-18 - 2016/12/13 (火) 17:25:45 - mon 平衡化すれば良いなら「クリアケースに挟む」とかはダメなのかな? だれか試してくれないかなと思っている。。

(無題) 削除/引用 No.5607-17 - 2016/12/13 (火) 14:55:08 - おお 泳ぐぐらいであれば大丈夫ということですね。ちなみに今は水平にフルんじゃなくってシーソーのようにフルタイプを使っていますのでミニゲル用のWB Boxに１０mlいれるとメンブレンが溶液の高さが変わるに連れて上がったり下がったりと言うのが見れましたので、まあこんな感じでいけそうだなと言う感覚です。 １０枚をいつものようにそれぞれのWB Boxにいれるとだいたい３０mlはいるのでそれでも節約されていていい感じです。WB Boxは名刺を入れるぐらいのサイズで、アマゾンなどでは名刺を入れで検索すると、WB Boxとかいう名目で試薬やさんが売っているのと同じものが見つかります（試薬やさんの名前が印刷されているかどうかぐらいですね、違うのは）。

(無題) 削除/引用 No.5607-16 - 2016/12/13 (火) 14:46:00 - おお メンブレンを切ってと言うのは確かにそうですね。今回はそうしたくなかったので思いつきませんでした。また間にろ紙作戦ですが、そういえば間に撥水性のセロファンを入れるというのはやったことがあります。多分明らかにセロファンにくっついているんですけどね、、、その時はあまり気にならなかったんですけど、、、実際にメンブレン間どの程度差があるかというとちょっとわかりません。

(無題) 削除/引用 No.5607-15 - 2016/12/13 (火) 09:57:55 - 中年 トピ主さんのこのケースは、液量（抗体量）をケチる必要が無いけれど、枚数が多いから一々バッグに封じたくないということですよね。 抗タグ抗体の腹水がふんだんにあるラボにいたときには、定量性を厳しく求められない実験の場合、azideを入れた一次抗体希釈液をメンブレンが泳ぐくらいタッパーに入れて使いまわしていて特に問題ありませんでした。メンブレンが浮いて乾くのを防ぐためにラップで落し蓋をしていました。

(無題) 削除/引用 No.5607-14 - 2016/12/13 (火) 09:42:32 - まっくろん 　自分で言っといてなんですが，濾紙だと液量の節約にはならないですし，再利用の為に回収する液量も減っちゃいますね。失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.5607-13 - 2016/12/13 (火) 09:38:35 - まっくろん 　メンブレンを切ってもいいなら，イナオプティカがマルチディッシュ出してますね（ttp://www.bio-bik.co.jp/product/series/list-category/code/246770000/）。あとはメンブレンの間に濾紙を挟むとかどうでしょう、、、ムラが出るかなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.5607-12 - 2016/12/13 (火) 09:11:43 - おお >パラフィルムの上に抗体液を滴下しておいて、その上に膜を被せるとか。 はい。これも希釈倍率が小さい抗体ではやることがあります。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5607-11 - 2016/12/13 (火) 09:10:19 - おお ありがとうございました、実はですね２枚のときは背中合わせでWBようトレイ（Box）でやってます。そういのはまあ大丈夫っぽいです。だから前のコメントで３枚以上というふうに書きました。

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