初めまして。rizuと申します。
マウス肝臓潅流法についての質問です。
現在、マウス肝臓潅流法にてマウス肝細胞の採取を行っているのですが、ほとんどの実験で細胞の間に細菌のような、不規則に動く粒が毎回現れます。大きさは細胞の100/1より小さいくらいだと思います。細胞数をカウントする段階で、細胞以外に、同じような不規則に動く小さな粒がみられます。
目で見た感じには増殖しているとは感じませんでした。自分は、細菌のコンタミなのかと思ったのですが・・・。確認は出来ていません。
お聞きしたいのは、
@これはコンタミであるのか
A以下のようなプロトコールで行ったマウス肝臓潅流法でコンタミすることはあるのか
B何が原因でコンタミしている可能性があるか
Cコンタミしないためにはどのような工夫があれば良いか
文字だけではなかなか伝わらないと思うのですが、なにとぞご教授願います。
マウス肝臓潅流法は以下のようなプロトコールで行っています。
マウス：週齢10前後のC57BL/6
場所：クリーンルームの外、研究室内
前潅流液：LPM(liver perfusion medium)
潅流液：ゲンタマイシンのみ添加した(150μl/500ml)DMEM＋コラゲナーゼ25mg＋HEPES120mgを混和したもの
培地：ゲンタマイシンのみ添加した(150μl/500ml)DMEM
服装：普段着、マスク着用、ゴム手袋着用
ハサミ、ピンセットはオートクレーブで滅菌しています。
前潅流液、潅流液も0.22μmフィルータ滅菌をしています。
手術台は消毒用エタノールで出来るだけ清潔にしています。
@マウスの全身に消毒用エタノールをよくかけ、マウスを開腹し、腸をよけて門脈と下大静脈を露出させる。
A門脈を切断し、24Gサーフローの鞘を門脈に挿入する。
B下大静脈を切断し、前潅流液35mlを流す。
C潅流液30mlを流す。(およそ５〜６分）
D肝臓をピンセットでつまみ、結合組織をハサミで切断し、肝臓をディッシュに移す。ディッシュ中には潅流液を10mlほど入れている。
Eクリーンベンチ内で、肝臓の被膜をピンセットで剥ぐ。あらかた剥いだら肝臓をピンセットでつまみ、ディッシュ中で振り、細胞を振り落す。
Fあらかた細胞を振り落したら、残った肝臓を捨て、培地を足して25mlにして、ピペッティングする。
G70μmセルストレーナーに通し、500rpm,1分で遠心する。
H上清を吸って、培地を加えて25mlとし、もう一度、500rpm,1分で遠心する。
I上清を吸って、肝細胞播種用培地を加え10mlとし、細胞数カウント。
J6wellプレート(コラーゲンT)に播種する。液量は1.5〜2mlほど。
K37℃,Co2 5%でインキュベート。3~4時間後に、肝細胞維持用培地に入れ替える。
※生細胞は10^7オーダーで得られています。
肝細胞播種用培地組成
(Williams E Medium (phenol red free)
HEPES、Fetal Bovine Serum (FBS)、Insulin、Dexamethasone、
L-alanyl-Lglutamine (dipeptide glutamine)、Gentamicin
肝細胞維持用培地組成
Williams E Medium (phenol red free)
HEPES、Insulin、Transferrin、Sodium Selenite、Linoleic acid
Dexamethasone、L-alanyl-L-glutamine (dipeptide glutamine)、Gentamicin
濃度などは分かりません。
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