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(無題) 削除/引用 No.5602-3 - 2016/12/13 (火) 12:56:38 - もーもー 返信遅くなりすみません。 >[Re:2] おおさんは書きました : > GFPなどでFACSをつかってソーティングするとか、ピューロで一時的なセレクションをするとかして濃縮したりしないのですか？ GFPや抗生剤での濃縮はしていません。実際、本番（？）の実験でCas9を使うときも抗生剤などでselectionしない方針で進めています。（抗生剤はCas9以外のところで1,2種類使います。GFPはselectionするのには使えそうです。） GFPや抗生剤でselectionして、濃縮しないとなかなかhetero duplexは確認できないでしょうか。 それとも、たまたま運悪くCas9で切りにくい箇所を選んでしまっているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5602-2 - 2016/12/08 (木) 07:10:12 - おお GFPなどでFACSをつかってソーティングするとか、ピューロで一時的なセレクションをするとかして濃縮したりしないのですか？

MultiNAを使ったhetero duplex assay 削除/引用 No.5602-1 - 2016/12/07 (水) 19:10:49 - もーもー MultiNAのhetero duplex assayでのサンプル濃度について質問です。 ヒトの遺伝子をtargetにCas9（pX330）を作成したときは、MultiNA（SHIMADZU）でのhetero duplex assayを使って実際に切れるかどうかチェックしています。 しかし、指定された濃度（50ng/µl、もしくはPCR産物を1/10程度に薄めたもの）では、hetero duplexのバンドが確認できず、かなり濃い濃度でassayしています。高分子マーカーや低分子マーカーよりかなり高いピークがでるくらいです。 そうすると、heteroのバンドは確認できますが、wild typeのバンドに大きさのずれが生じ、難儀しています。（切れているのは切れているようです） PCR産物は150-400bp程度です。 皆様はMultiNAでのhetero duplex assayはどのようにされていますか。 しっかり切れていれば（Cas9の活性が高ければ）、指定濃度でもはっきりとheteroのバンドが分かるものなのでしょうか。HEK293Tにlipofectamine2000を使ってtarnsfectionすることが多いので、導入効率は悪くないと考えていますが。 ご意見いただければ幸いです。よろしくお願い致します。

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