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(無題) 削除/引用 No.5599-4 - 2016/12/06 (火) 23:37:17 - おお 4%PFAはこの手の実験では濃すぎます0.1％から0.５％ぐらいでしょう。場合によってはもっと下げてもいいかもしれません。Chipアッセイの方法に習うといいかと思います。PFAがあまりうまくいかないならバイオケミカル用のクロスリンカーなども検討してもいいかもしれません。 同じ蛋白同士は、その蛋白がホモオリゴマーを形成していれば可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.5599-3 - 2016/12/06 (火) 18:21:08 - マリン おおさん ありがとうございます クロスリンク法についてですが、以前に4%PFAを用いてCBBでの検出で一度やってみました。 その結果、そのタンパク質もしくはプロテアソームどうしがクロスリンクしてしまっているのか、そのタンパク質のバンドとプロテアソームのバンドが全て薄くなり上にシフトしていました。 ウェスタンでの検出はやっていないので早速やってみようかと思いますが、同じタンパク質どうしでのクロスリンクというのはあり得るのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5599-2 - 2016/12/06 (火) 17:38:17 - おお 蛋白、プロテアそームのコンプレックスができた状況でクロスリンクを施し、SDSPAGEまたはクロスリンク後に１％SDSなどで変性し蛋白解離後に１％TritonX100 と0.１％Deoxycholateを含むバッファーで１０倍以上希釈したりして、抗体が働くような条件に戻してからIPする。クロスリンクされているとされた蛋白の分子量分バンドがシフトすると考え付いているサブユニットが予測できるなら、その抗体でシフトしたバンドが検出されるか確認できると思う。

プロテアソームの構造の解離 削除/引用 No.5599-1 - 2016/12/06 (火) 17:24:48 - マリン プロテアソームとユビキチン非標識タンパク質を反応させて、プロテアソームの構成サブユニットのどこにそのタンパクが結合しているのかを調べています。 Flagタグ付きのプロテアソームとタンパク質を反応させた後、ビーズでプロテアソームを引っ張ってきたところ、そのタンパク質もプロテアソームにくっ付いてくることがわかりました。 次に、タンパク質がプロテアソームのどのサブユニットに結合しているのかを調べるために、プロテアソームとタンパク質を反応させた後、プロテアソームの構造を解離させタンパク質で引っ張ってきてどのサブユニットが結合しているかウェスタンで見るといった方法を考えています。 しかし、プロテアソームの構造を（サブユニット単位まで）解離させる方法が分かりません。 プロテアソームの構造を（サブユニット単位まで）解離させる方法をご存知の方、もしくは違った手法でのサブユニット特定方法をご存知の方ご教授よろしくお願いいたします。

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