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(無題) 削除/引用 No.5598-13 - 2016/12/06 (火) 14:54:42 - おお >[Re:10] APさんは書きました : > >PBS溶解の一次抗体にアザイドを加えてwesternを行ったところ、いまいちではありますがバンドが出ました。いまいちというのが阻害効果なのかもしれませんが。 > > そりゃ別の問題だ。 あまりにも高い濃度でつかってて、抗体やメンブレンの抗原に直接反応しているとか、、、

(無題) 削除/引用 No.5598-12 - 2016/12/06 (火) 14:45:07 - hansen 重ねて御回答ありがとうございます。 阻害機構として、HRPと基質の反応をアザイドが阻害するようなことを考えていました。なので、一次と二次抗体反応の両方の後にwashのステップがあるのに、何故二次抗体のアザイドのみが問題になるのか理屈が解りませんでした。 実際は反応の阻害というより、酵素を失活させる機構なので、一次抗体に含まれていても洗い流されてHRPとは接触しないが、二次抗体の場合は接触どころか保存している段階で高濃度で共存するので、HRPが失活してしまい、その後洗い流されるとかは関係無いということだと解りました。

(無題) 削除/引用 No.5598-11 - 2016/12/06 (火) 14:28:33 - AP >一次抗体にアザイドを加えても、その後washのステップがあるので、大部分のアザイドは除去されると考えられます。しかし、二次抗体後もwashのステップがあるので、恐らく残存するアザイドが有意に阻害すると考えられます。 どういうロジックで何を言おうとしてるのか、さっぱりわからんねえ。

(無題) 削除/引用 No.5598-10 - 2016/12/06 (火) 14:27:04 - AP >PBS溶解の一次抗体にアザイドを加えてwesternを行ったところ、いまいちではありますがバンドが出ました。いまいちというのが阻害効果なのかもしれませんが。 そりゃ別の問題だ。

(無題) 削除/引用 No.5598-9 - 2016/12/06 (火) 14:08:48 - おお 細かい知識はおいといて、不可逆的な阻害と推測できないかなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.5598-8 - 2016/12/06 (火) 13:38:50 - AP Azideは呼吸毒であり防腐剤となると同時に、peroxidaseを不可逆的に阻害するということはご存知か？　Azideは鉄などの金属とアジ化物を作るため、ヘム鉄を含む酵素は死んでしまう。蛍光標識やアルカリフォスファターゼ標識（これも金属イオン（マグネシウム）を含むんだが）には影響ない。

(無題) 削除/引用 No.5598-7 - 2016/12/06 (火) 12:58:22 - hansen 多くの御回答大変ありがとうございます。 市販の抗体にも添加されているなら、阻害はあり得ないと思います。 ただ、洗い流されるなら、何故二次抗体には加えてはいけないのか、御存知な方がいらっしゃったら教えて頂けるようお願いします。

(無題) 削除/引用 No.5598-6 - 2016/12/06 (火) 12:45:48 - おお WBに使えるとされている抗体にアザイドが入っている商品があると思いますが、実際阻害のために使えないなら矛盾を感じませんか？

(無題) 削除/引用 No.5598-5 - 2016/12/06 (火) 12:27:44 - １２３４５６７ 全く影響ありません。実際、多くの市販抗体に添加されています。 もともとかなり低濃度ですし、１次抗体反応後の洗浄中に除去されてしまいます。azide　freeの抗体もありますが、これは別の理由によるものとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.5598-4 - 2016/12/06 (火) 12:26:27 - おお >二次抗体後もwashのステップがあるので、恐らく残存するアザイドが有意に阻害すると考えられます。 ?

(無題) 削除/引用 No.5598-3 - 2016/12/06 (火) 12:25:19 - おお 洗って流されているのになぜ阻害されるのだろうか、、、

(無題) 削除/引用 No.5598-2 - 2016/12/06 (火) 12:09:51 - 斎藤飛鳥推し No problem.

westernの一次抗体へのアザイドの添加 削除/引用 No.5598-1 - 2016/12/06 (火) 12:07:40 - hansen westernの二次抗体にアザイドを加えると、HRPによる発光が阻害され、何も見えなくなるという話を聞きましたが、これは一次抗体でも同様なのでしょうか？ 一次抗体にアザイドを加えても、その後washのステップがあるので、大部分のアザイドは除去されると考えられます。しかし、二次抗体後もwashのステップがあるので、恐らく残存するアザイドが有意に阻害すると考えられます。 なので、一次抗体のアザイドも阻害すると考えられますが、実際に血清や精製後のPBS溶解の一次抗体にアザイドを加えてwesternを行ったところ、いまいちではありますがバンドが出ました。いまいちというのが阻害効果なのかもしれませんが。 当然アザイドの有り無しで調べれば判ることですが、アザイド無しの抗体の調達に時間がかかるので、まずは常識的にどうなのかお伺いしている次第です。 どうかよろしくお願いします。

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