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(無題) 削除/引用 No.5594-7 - 2016/12/08 (木) 20:55:29 - 弘法 ディタージェントの組合せで非酵素的に酵母の細胞質成分を抽出すると称する試薬がいくつか市販されています。 www.thermofisher.com/order/catalog/product/78990 www.merckmillipore.com/JP/ja/life-science-research/protein-sample-preparation/protein-extraction/yeast-cell-lysis/aUCb.qB.KjUAAAFBJy9lvyz8,nav www.sigmaaldrich.com/japan/lifescience/proteomics/cellytic.html#CelLytic_Y aproscience.com/item/234/ また、溶壁酵素を使っていると思しき製品も。 catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100007619 www.atto.co.jp/site/products/epreagent/subcellularfractionation/WSE-7423 www.funakoshi.co.jp/contents/8809

(無題) 削除/引用 No.5594-6 - 2016/12/08 (木) 19:45:59 - ぴきあー >>monさま 培養細胞について、ご意見ありがとうございます。 培養細胞や昆虫細胞も検討したのですが、十分な設備やノウハウもないので、酵母から始めてみようと考えていました。Pichiaであれば、現在の設備で問題なく実験できそうです。 昆虫細胞は立ち上げまでが一苦労という話を聞いたことがあるのですが、どうなんでしょう。 まずは、ダメ元でPichiaを試してみます。 フットワークを軽く、ダメならあまりコンストラクトをいじらずに、他の系を試してみます。

(無題) 削除/引用 No.5594-5 - 2016/12/08 (木) 19:29:52 - ぴきあー >>おおさま 酵母分泌発現の比較論文を見つけてくださりありがとうございます。 これを見ても、細胞外タンパクが多い... >まあ一般的なことしかいえませんけどフォールでィングのプロセスは膜をまたぐので違ってくるでしょうし（もしかしたらこれがこうをそうして偶然うまくフォールディングするかもしれませんが、酸化還元状態も大きく違いますし糖鎖修飾環境も大きく違います。 まさにこのようなことを心配しております。 >酵母の破砕は酵素を使って細胞壁を分解すれば、強力な破砕力を持った装置はいらないはずです。 調べたら、 Zymolyaseというのが出てきました。それほどラニングコストはかからないようですね。

(無題) 削除/引用 No.5594-4 - 2016/12/05 (月) 06:09:01 - おお 酵母の破砕は酵素を使って細胞壁を分解すれば、強力な破砕力を持った装置はいらないはずです。

(無題) 削除/引用 No.5594-3 - 2016/12/03 (土) 08:55:53 - mon 真核生物の細胞内タンパクなら出芽/分裂酵母・バキュロウィルス(Sf9,Sf21)が定番かなと思います。 最近は浮遊培養系293細胞・CHO細胞も10^7cells/mL以上まで培養可能な培地・ベクターが販売されていて、いくつか試しましたが結構良いです。高価ですが、通常のdish等の培養細胞内で高発現させて問題ないなら、条件検討がほとんど要らず時間短縮になるので、うちではメインの発現系として採用しています。導入試薬もセットになっているものも有ります。 浮遊培養の場合CHO細胞の方が293細胞より丈夫（死ににくい）ですが、細胞塊になりやすい欠点があります。 また8%CO2設定が必要だったりしますがHEPESを添加すれば5%CO2でもbestではないですがそれなりに可能です。回転培養を推奨しますが、dishやフラスコ等で静置培養も可能です（必要枚数は多くなります）。 無血清培地等を安価に済ますなら、DMEM/F12+ITS+HEPES+CD-lipid+Yeastlate( or YeastExtract)　(+Glucose) +PluronicF68(静置なら不要）、血清が使用可ならITS+CD-lipidの代わりに2~4%FBSで、3~5x10^6cells/mLくらいまで増殖します。Yeastlate (YeastExtract）Glucoseは栄養強化剤です。 遺伝子導入はPEI-MAXを用いて高密度(4-10^6cell/mL)で短時間30分〜1hr処理（＞遠心・培地交換）＞その後希釈し培養、で良好な結果(>導入効率70%)を得られます。細胞内発現ならその後定常期まで培養すればよいと思います。分泌タンパクはもう少し長めかな。

(無題) 削除/引用 No.5594-2 - 2016/12/02 (金) 07:14:14 - おお ttp://www.ifsc.usp.br/~ilanacamargo/FFI0740/pichia.pdf 20 pageに彼らがしらべた範囲内で合成された蛋白の一覧がのってます。 細胞内の蛋白としてはパット見て判断のつくのはトポイソメラーゼですかね。。。 実際にリファレンスを見ると分泌させているようです。 ttp://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022903003272 まあ一般的なことしかいえませんけどフォールでィングのプロセスは膜をまたぐので違ってくるでしょうし（もしかしたらこれがこうをそうして偶然うまくフォールディングするかもしれませんが、酸化還元状態も大きく違いますし糖鎖修飾環境も大きく違います。 もう少し根気よく調べればいくらかまだインフォメーションは得られそうですが。。。 まあ経験がある人、よく調べたことがある人がいればいいですね。

Pichiaなどの分泌系の得手不得手 削除/引用 No.5594-1 - 2016/12/01 (木) 22:22:02 - ぴきあー いつも勉強になっています。 最近扱っているタンパク質が真核生物由来のため、大腸菌では発現量も少なく、発現してもインクルージョンボディになります。コドンはもちろん、タグや培養条件を検討したのですが、この度ホストを変えようと思いました。 PichiaやBreviobacillusなどを検討しているのですが、成功例を見ると分泌タンパク質・細胞外タンパク質が多いように思われます（周りで成功している人も分泌タンパク質です）。私のターゲットは細胞質で機能するのですが、細胞外に分泌されたとして、正しいフォールディングをとるのか心配です。 やってみなけりゃわからない！とは思うのですが、分泌発現系の得手不得手（成功した・失敗したなど）を教えていただけませんか？ （α因子を付加せずに細胞内に発現することも考えたのですが、酵母を破砕する器具がないことと、大量発現を目的としていることから、今回は分泌発現で考えています）

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