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(無題) 削除/引用 No.5585-4 - 2016/11/29 (火) 16:10:26 - asan 普通にTrizol 等で回収したのちエタチンメイトみたいな共沈剤をつかって回収して定量しないでそのままRTで行けるはずです。この方法で数千細胞とかのRNA seqをやってるラボすらあるのでng/ulオーダーあるならまず大丈夫かと。 あとは、RTを何回か行うとかそういうのもありかもしれませんね。 ただし、この方法だとdelta CT法だとちょっとぶれやすいので、可能であれば検量線は毎回引いた方が良いとはおもいますが。

(無題) 削除/引用 No.5585-3 - 2016/11/29 (火) 12:48:02 - ema レーザーマイクロダイセクションでは頑張ってたくさん切ったつもりでも少量しか取れないことが多いです。 ナノドロップでの10ng/ul以下の濃度は信じない方が良いです。最近はpicoタイプもあるかも。 AgilentバイオアナライザーなどでPico kit：微量泳動検出で概算しています。 私が昔だったのでバイアスかかるの承知で増幅法を使いましたが その後はDOHN Joeさんも言っているような「高効率を謳うRT酵素」 https://www.funakoshi.co.jp/catalogs/%E8%A9%A6%E8%96%AC/%E9%81%BA%E4%BC%9D%E5%AD%90%E5%B7%A5%E5%AD%A6/65022 https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/jp/seminars-events/lcm-expression.pdf のようなのを参考にすれば

(無題) 削除/引用 No.5585-2 - 2016/11/29 (火) 12:36:01 - DOHN Joe もっと濃いRNA溶液(100-1000 ng/uL 程度)を今回のサンプルとは別に持っていませんか？ できれば今回のサンプルと同じ組織由来がよいと思います。 もし持っていれば、1, 3, 9, 27 ng/uLに薄めて、各濃度3つずつRT-PCRして定量性があるか検証すればよいと思います。 少量のRNAから効率的にRT-PCRすることについては、RTのステップの方がPCRのステップよりもネックになるだろうと思います。 高効率を謳うRT酵素を選んで、RNAの終濃度が出来るだけ高くなる条件にして、RNAと酵素が出合いにくいと想定されることから反応時間は長くしてみるのがよいのではないかと思います。

微量のRNAでの効率的なリアルタイムPCRの方法について 削除/引用 No.5585-1 - 2016/11/29 (火) 11:22:40 - 大学生 いつも参考にさせていただいております。 マウスの凍結切片をレーザーマイクロダイセクションを用いてサンプルを採取し、リアルタイムPCRを行いたいと思っています。 しかし、ナノドロップでのRNAの収量が2.5 ng/µlや3.7 ng/µlといったほんの少ししか検出されませんでした。 少しのRNA量でも効率的にリアルタイムPCRができる方法をご教授していただけないでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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