BioTechnicalフォーラム [細胞のウォッシュをDMEMで]

細胞のウォッシュをDMEMで

No.5574-TOPIC - 2016/11/26 (土) 11:07:35 - DMEM

今いる所ではDMEMの方がPBSよりも安く（もちろん自作のPBSが一番安上がりですが、コンタミ等考えると培養細胞には市販品を使いたい感じです）、ふと「血清を除くためのトリプシン処理前段階のウォッシュは、FBSを加えていないDMEMでやってもいいんじゃないか？」と思ったのですが、どうなのでしょうか？

理論上問題ない気がするのですが、何か見落としている問題点がありましたらアドバイスいただけると幸いです。
　

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No.5574-11 - 2016/11/28 (月) 23:50:22 - たていす

DMEMのpHが５％CO2のもとで中性になることも考えに入れておくべきかもしれない。

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No.5574-10 - 2016/11/28 (月) 07:00:41 - おお

DMEM formulationでCaは２mM弱、Mgその半分ぐらいでしょうか。
例えば１０cmでピペットでなるべく吸い取ってのぞいたとして０．５mL残ったとして１mLのトリプシンEDTAをいれると（たしかEDTAは１mMだったと思うので）計算上十分Mg,Caを吸収してくれると言う計算になるけど、Mg,Caを保有している蛋白とのコンペティションになることを考えるとない方が断然いいわけで、、、

あなたの細胞でやってみてプラクティカルベースでもかまわないかもしれません。

ttp://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-formulations/dme.html

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No.5574-9 - 2016/11/27 (日) 21:51:49 - おお

むかしオートクレーブしたとき釜にコンタミしているLPSの混入などが指摘されることがありましたねぇ。。。
大腸菌などオートクレーブするとそういう可能性はあるんだと思いますが、たまたまなんかこぼれていて釜で菌が増殖していたヒストリーがあったりとか。

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No.5574-8 - 2016/11/27 (日) 20:58:46 - ぬ

ウチでは自分たちでリン酸塩などの粉末を混ぜて、オートクレーブして使っていますが問題ないです。
10Xのストックを作っておいて、そこから希釈して使っています。

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No.5574-7 - 2016/11/26 (土) 15:08:00 - おお

CaイオンやMgイオンは細胞の接着に必要な因子で、これを除かないと細胞同士やディッシュのそこにしっかりとくっついていて、トリプシンの侵入を防ぐので非常に剥がれにくいです。まあトリプシン溶液にEDTAが入っているのがたいがいだと思いますので、剥がれやすい細胞はトリプシンインヒビターが除けていれば、あるいはEDTAが十分量であればなんとかなるのかもしれません。

大胆な人はPBSであらわずにトリプシンで洗ってからトリプシン処理する人もいます。

マイコプラズマとかはまず大丈夫でしょうけど、、、試薬のグレードも試薬特級程度なら大抵は大丈夫と思ってますが、それは扱うものがどれくらいセンシティブなのかなどにもよるかもしれません。ただ売られているPBSもそんな超きれいなものを使っているかどうかというとそうでもないような気がしますけどね。

洗うぐらいなら生食(0.9% NaCl)でも大丈夫だろうなとも思います。

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No.5574-6 - 2016/11/26 (土) 14:31:09 - ｗｗｗｗｗ

「培養細胞グレードのリン酸塩」
とやらが本当に必要だと思ってたり、
オートクレーブ滅菌が不十分だと思うなら、
DMEMがいいんじゃないでしょうか？
自分の満足感を優先するならの話ですが・・・

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No.5574-5 - 2016/11/26 (土) 13:41:07 - DMEM

おぉ（←おぉさんではなく感嘆詞）、お二方が同時に同じことをご指摘ということは良くなさそうですね。…しかし無知で恐縮なんですが、それらのイオンは単にトリプシン処理に問題を起こすかも、ということでしょうか？
実は既に試して、用いている細胞がHEK293と非常にはがれやすいものであるからかもしれませんが、特に何も問題がなかった気がしたのですが、トリプシン処理に限らずウォッシュステップでは今後の培養のためにイオンも洗い流した方がいい、ということだったりする感じですかね…？（しかしすぐにまた培地を入れるわけで、それは問題じゃない気もしますが…）

コンタミについては、培養細胞グレードのリン酸塩がないため、ひょっとすると混ざっている微量レベルの化学物質やオートクレーブでも不活性化できない何がしか（マイコプラズマとか？オートクレーブで死なないのか不明なので間違ったこと言ってるかもしれませんが）の混入が心配なため、市販の出来合いのPBSがいいかな、と思っている感じです（そんなことを気にする人がワケも分からず培地でウォッシュをしようとしているのは片手落ちで笑い話かもしれませんが）。
これも、培養細胞グレードではない粉末から作ったPBSでもオートクレーブすれば問題ない、という感じであれば、それが一番かなと思えるのでそうしようかと思うのですが、ご意見ある方いらっしゃいましたらアドバイスいただけると幸いに思います。

私なら・・・・

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No.5574-4 - 2016/11/26 (土) 13:18:12 - 774R

>コンタミ等考えると培養細胞には市販品を使いたい感じです

私なら、コンタミ等考えるとPBSは自作してオートクレーブして使いたい感じです。完全自作は手間がかかるし調整のミスもあるかもしれないので、粉末タイプやタブレットタイプのものを溶かしてオートクレーブですね。

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No.5574-3 - 2016/11/26 (土) 11:40:21 - おお

カルシウムやマグネシウムが気になります

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No.5574-2 - 2016/11/26 (土) 11:26:50 - mon

Ca,Mgが含まれているので、適さないかも。