現在遺伝子組み換えを行っており、ライゲーションで連結させたプラスミドを大腸菌（HB2151株）に形質転換させています。しかし、形質転換体をPCRで確認してみると挿入したインサートの大部分が欠損していることがわかりました。大腸菌の株をHB2151株からTG1株に変えても同じ結果でした。なぜこのような遺伝子の欠損がおこるのかがわかりません。
プラスミドベクター（4800bp）とプラスミドインサート（700bp）はどちらもPCRで作成しており、それぞれ2種類の制限酵素（Sfi I、Not I）で処理しています。それぞれのサイズは調製後電気泳動で確認しています。
その後、調製したプラスミドベクターとプラスミドインサートをTakaraのLigation Kitを用いてライゲーション反応を行っています。ライゲーション後に電気泳動で確認を行うと5500bp付近に新たなバンドが見られるため、ライゲーションはうまくいっていると思います。
その後、ライゲーションして得られたプラスミドを大腸菌に形質転換しています。形質転換は、DNA溶液が10分の1倍になるようにコンピテントセルを加え、氷冷15分、ヒートショック42℃で90秒、氷冷5分し、LB培地に加え1時間培養し、Amp含有プレートにまき培養しています。
その後、形質転換で得られたコロニーをインサートをはさむように設計したプライマーを用いてPCRを行うと、本来のバンドの長さより200bp程度欠損していることがわかりました。DNAシークエンスでも確認したのですが、やはり200bp程度欠損していました。
この遺伝子の欠損がなぜ起こるのかがわかりません。その原因、対策を教えて頂けると助かります。よろしくお願いします。 |
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