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(無題) 削除/引用 No.5568-10 - 2016/11/30 (水) 12:00:14 - Island 皆様たくさんの意見をどうもありがとうございます。 大変勉強になりました。 少し時間がかかりましたが、今までのサンプルを一対ごとのプライマーでPCRをかけ直したところ、3本のプライマーで同時にかけたときと同様の結果となりました。現在扱っているKOマウスに関しては、3本のプライマーが同時に使用できることがわかりましたが、プライマー同士がコンペティションを起こすこともあるということですので、新たなKOマウスを扱う際には慎重に対応していこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.5568-9 - 2016/11/26 (土) 18:32:12 - asan 通常ジェノタイピングはあくまで”定性的”なものなので、KOとヘテロとWTがそれぞれちゃんと識別可能な3セットのプライマーを設計して最低でもそれらが確認できる条件でRTーPCRをかけるのが前提だと思います。極論いえばextensionの時間とかアンプリコンの長さや増えやすさなんかによっても当然増えやすさは変わるわけだし、逆に言えばそれを利用してデリーションを調べたり、RT-PCRでゲノムDNAのコンタミをによる擬陽性を避けるなんてことは通常してるかと思います。 だから、当然長さが極端に長いのと短いのを混ぜると増えにくい事はありますから、条件検討をちゃんとやってね、としか言いようがないでしょう。極論いえば、毎回ポジコンとネガコンを置くべきですが、ちゃんと判断できる条件って分かってるならいいのかなとは思います。

(無題) 削除/引用 No.5568-8 - 2016/11/23 (水) 01:25:21 - 経験者 APさんは >有り無しの判定なので、増幅が悪くなるくらいでは見落とすことはないと思います。 と言われますが、見落としそうになった経験があります。 3本のプライマーってのは WT用のフォワード、Neo用のフォワード、共通のリバース とかの形ですよね。で、産物の長さが違う（例：WTは400bp、Neo (KO)は250bpとか）のを利用してgenotypingをする。ヘテロなら両方バンドがでると。 増幅効率が同じであれば上記プライマーを1:1:2で使えばいいけれど、この比率でやると長い方が検出されにくいから、2:1:2で使えと先輩からいわれてやっていました。ある時、DOHN Joeさんと同じく長い方の産物がかなりうっすらと見えたことがあり、もしかしてこれで見落としがあったのではと心配になって一対ごとのPCRをやってみたところ、KOと思っていたのが実はヘテロだった、ということがありました。調べなおしたらKOと思っていたマウスの3分の一以上が実際はヘテロで、かなり危ないところでした。 しかし一対ごとのPCRはやはり面倒で、結局は長いほうのフォワードプライマーの比率を大幅に上げることで問題を解決しました。数種類のプライマーセットで最適化を試しましたが、4:1:2できれいに出るものもあれば、ものによっては比率は12:1:2とかになりました。

(無題) 削除/引用 No.5568-7 - 2016/11/22 (火) 23:11:43 - DOHN Joe コンペティションがかかって2つ出来る産物の内の片方がかかりにくいということはあり得ることです。そして、鋳型の調整具合等によってかかりにくい方の産物が検出できないこともありえますし、実際にありました。同時にPCRにかけた別個体についてかかりにくい方の産物がうっすらと検出されたことから偽陰性があるかもしれないと考えてプライマー2本を2セットにしたら陽性だと判明しました。

(無題) 削除/引用 No.5568-6 - 2016/11/22 (火) 17:09:12 - AP >3本同時に調整するとどちらか一対のプライマーの増幅が悪くなるのではないかと心配になってきました。 どういう原理でそういう事がおこるかもしれないと考えるのでしょう？ というところなんですけど。しかも一方だけに限って全く検出できなくなるんじゃないか？ってことですよね。

(無題) 削除/引用 No.5568-5 - 2016/11/22 (火) 16:52:41 - おお あ、実際に検出できている系なので気にすることないってことですね。

(無題) 削除/引用 No.5568-4 - 2016/11/22 (火) 16:51:22 - おお APさん。コンペティションがかかって片方のかかりが悪くなるってことはないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5568-3 - 2016/11/22 (火) 16:28:02 - AP 私の読解力が足りないのか、意味がよく取れないのですが、 >プライマーは3本使用して、floxバンドもしくはWTバンドが検出されます。 共通プライマー１種とアリル特異的プライマーが２種ということでしょうか。 >genotypingに偏り(ホモ・ヘテロ・WTの割合)があり、 遺伝子型の分離比が偏っているということでしょうか。でしたら、genotypingの偏りではなく、genotypの比率（または分離比）ですね。 だとしたらどういう分離比が予想されていているところに、実際にはどういう比率に偏っているのでしょうか。もっと言うと、二項検定とかフィッシャーとかで検定すると、その偏りがあり得る範囲かありえない範囲か確率的に判断することができますね。 また、確率的に非常に低い偏りだとしても、それがその遺伝子型の特性かもしれないので（特定の遺伝子型が致死とか妊性が低いとか）、偏っているからおかしいということもないでしょう。 >3本同時に調整するとどちらか一対のプライマーの増幅が悪くなるのではないかと心配になってきました。 有り無しの判定なので、増幅が悪くなるくらいでは見落とすことはないと思います。つまり、ヘテロ接合体で両方のアリルががちゃんと同時に検出できる例があるのに、ある時は一方のアリルしか検出できずもう一方は全く検出できないということはありえないと考えます。

(無題) 削除/引用 No.5568-2 - 2016/11/22 (火) 15:14:50 - おお まずは今までやってきた方法論ぽいので結果を見せてもらってはどうでしょうか。 偏りがあるというのもそのトランスジェニックマウスの特徴かもしれませんので、それもいままで蓄積したデーターがあれば参考になるでしょう。 もちろん違う反応チューブでそれぞれを検出する方法論は変な方法でもないわけで、１チューブで反応するのと並行してやって間違いがないか確認しながらやっていき１チューブでできそうであればそれ以降１チューブでやっていくというのもありですが、、、 ただラボでの現状がわからない外部の人があれがいいこれがいいと言っても始まらないですよね。。。

マウスのgenotyping 削除/引用 No.5568-1 - 2016/11/22 (火) 14:47:29 - Island いつも参考にさせていただいております。 最近研究でKOマウスを扱うようになり、ラボの先輩にgenotypingを教わりました。プライマーは3本使用して、floxバンドもしくはWTバンドが検出されます。当初は教わった通りプライマー3本を同時に調整してPCRをかけていたのですが、genotypingに偏り(ホモ・ヘテロ・WTの割合)があり、3本同時に調整するとどちらか一対のプライマーの増幅が悪くなるのではないかと心配になってきました。先輩に質問したところ、そんなことは考えなくても大丈夫だと答えてくれましたが、マウスのgenotypingが間違っていれば実験の意味がなくなってしまうので、曖昧にはしたくないと考えております。 皆様の中にそのような経験をした方はおられますでしょうか？もし対策があればご教授していただけますと幸いです。 ※当然一対ごとにPCRをかけてみるつもりですが、実験の手間を省くためにできれば3本同時に調整したいと思っております。

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