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(無題) 削除/引用 No.5553-6 - 2016/11/19 (土) 10:10:41 - wせdrftg 専門外なのでよくわからないけど、SDS-PAGEでの見かけの分子量が変化するような翻訳後修飾はたくさんあるので、「想定している翻訳後修飾が起きると分子量が５Kほどシフトする」から「５Kシフトしていれば想定している翻訳後修飾が起きている」ということにはかならずしもならないのではないか、となんとなくおもう。修飾体に特異的な抗体（もしあれば）を使用してwestern blottingするとか、あるいは比較的小さい分子量の蛋白質ならば抗体で免疫沈降で取ってきて、MALDI-TOFF MSなどで正確な分子量のシフトを測定する（抗体は大きいので、免疫沈降物をそのまま分析してもたぶんじゃましないとおもう）とかよりよい方法があるとおもう。ゲル濃度をいろいろ変えて頑張るよりは、まだ時間を有効に使えるとおもう。

(無題) 削除/引用 No.5553-5 - 2016/11/16 (水) 15:26:26 - R 分離して"見る"のが目的なら、二次元やってみるとか

(無題) 削除/引用 No.5553-4 - 2016/11/15 (火) 14:03:56 - おお どうなんでしょうかねぇ。現状別れているけどあまりきれいに別れないとかで定量できるほど綺麗にいかないとか満足してないのかなぁとも思ったりもするんですが、、、特に長時間流すとバンドもなんか少し汚く見えたりすることもあるし。現状時間をかければ解決するならそのままの条件でやってしまうのも確かに結局は近道です。 個人的には条件を探求しようというのは私は良いと思ってはいます。というのもどれぐらいのゲル濃度でどの領域でどれくらいの分離能が得られるのか、オプションとしてどのような事が（バッファーの選択とか添加物とか）あるのか把握しておくことはいろいろ長期的に見ても有益かもしれないと思うのです。 まあかといって工夫してみたものの分離できずやり直しではちょっと要領が悪いとも思えますので、余裕がある時並行してやりながら改善できるか見てみるのも手かもしれません。 また、各メーカーマーカーがどのGelでどれくらいのところに来るか示されたものがありますのでそれを見ながら４０と４５でしたっけ、それの前後のマーカーの移動距離差が一番大きい条件を使うというのも手です。 ttp://www.abcam.com/optiblot-sds-gel-4-8-8-x-10cm-12-well-ab119208.html#description_images_2 ttp://www.bio-rad.com/en-us/product/polyacrylamide-reagents-precast-gels ここのChoosing the Right Precast Gelのところ。 バッファー組成がクラッシックなものと違うかもしれません。けど印象としてもう少しゲル濃度を下げても良さそうかなぁという気はします。 時間的短縮はできないかもしれませんけどもしミニゲルを使っているなら大きいゲルで流してみるのも手かなと思いますが、道具が揃ってないとできませんね。。。

(無題) 削除/引用 No.5553-3 - 2016/11/15 (火) 12:47:56 - TS 2時間程度の泳動で分けれて問題ないならそれでよいのでは？ 目的タンパク質の大きさがわかりませんが、 マーカーなんかを見て、もう少し調整できそうなら、したらよいと思います。 修飾の種類に応じて特徴のあるSDS-Page（Phos-tagなど）があると思います。 ただ、今の実験条件でとりあえずできているとすると、 新たな実験系を立ち上げるために、条件検討の労力、コストがかかるということ、一方で泳動時間が短くなったとしても、1時間弱くらいはかかると思うので、それほど劇的に時間短縮はされない、ということを天秤にかけて考えるところでしょうか。 もちろん新たに立ち上げる実験手法に別のメリットがあれば、それも考慮しながらですかね。

(無題) 削除/引用 No.5553-2 - 2016/11/15 (火) 12:41:45 - おお 40-50あたりだともうちょっと低い濃度でも良さそうですがやってみないとわからないかもしれません。ゲルに１０％ぐらいのグリセロールを入れると若干バンドがシャープになるような感覚がありますまたすこし真ん中から下辺りの分離が良くなるかなぁっと。

40と45kDaをはっきり分離する方法 削除/引用 No.5553-1 - 2016/11/15 (火) 12:10:46 - 紗栄子LoVe 御世話様です。タイトルの通りですが翻訳後修飾の如何で5 kDaの差を示すタンパク質を相手に孤軍奮闘の身です。今は10 % SDS-PAGE gelでできるだけ長く流して強引に分離をしていますが、泳動で2時間かかるんですよ。ゲルの濃度を濃くすると分離悪くなるし、薄くすると・・どうなんでしょうか。

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