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(無題) 削除/引用 No.5546-18 - 2016/11/14 (月) 06:03:19 - おお まあミスアニーリング、スリッページなどもあるでしょうから。。。

訂正 削除/引用 No.5546-17 - 2016/11/13 (日) 08:00:44 - えっとね >BamH1ではなくて、GGGとCCCがアニールしたんだと思うが。 5'-GGGGGATCCNNNN-3' 3'-CCCCCTAGGNNNN-5' 配列を間違えたので訂正です。 いずれにしてもCCCから先に伸びるとは思えないのです。

(無題) 削除/引用 No.5546-16 - 2016/11/13 (日) 07:43:10 - えっとね >BamH1ではなくて、GGGとCCCがアニールしたんだと思うが。 5'-GGGGGATCCNNNN-3' 3'-NNNNGGATCCCCC-5' アニールはするけど、CCCから5'側には伸びないから何も起きなくね？ >こんなことでどうこう言っている暇があればとっと正しいクローンをとって前に進むべし。ただの時間の無駄使い。 正しいクローンは既に取得済みと書かれているし、それを使ってすでに実験を進めながら、こんなところでどうこう言ってる可能性はどうやって棄却した？ よくいるんだよね。両立する事象にもかかわらず、「〇〇する前に」とか「○○する暇があれば」とか言っちゃう人。

(無題) 削除/引用 No.5546-15 - 2016/11/13 (日) 02:36:40 - TK-1 こんなことでどうこう言っている暇があればとっと正しいクローンをとって前に進むべし。ただの時間の無駄使い。

(無題) 削除/引用 No.5546-14 - 2016/11/12 (土) 20:50:13 - 横 BamH1ではなくて、GGGとCCCがアニールしたんだと思うが。

(無題) 削除/引用 No.5546-13 - 2016/11/12 (土) 16:12:32 - ん？ 5'GGGGGATCC・・・3' というオリゴDNA同士はGGATCCの部分しかアニールしませんよね？ 5'GGGGGATCC・・・3' と 5'・・・GGATCCCCC の組み合わせなら6塩基に渡ってアニールしますけど・・・。 プライマーダイマーなどの副産物なども考えてみましたが、、 GGATCCGGGGGATCCの生成する理由が分かりません。

(無題) 削除/引用 No.5546-12 - 2016/11/12 (土) 13:53:33 - おお 悪さをするやつは完全な２重鎖のものでなくてもいいということを忘れないでください。今のプライマーでアニーリング温度をバンドが出なくなる直前ぐらいまでに上げて、サイクル数をなるだけ減らすだけでもうまくいく可能性が高いと思います。

(無題) 削除/引用 No.5546-11 - 2016/11/12 (土) 13:14:16 - しろ おおさま、 引き続きありがとうございます。 ゲル抽出して、PCR後に1 kbだけを切り出しているんです。2 kbは限りなくコンタミする可能性は低いと思っていました。なので、ライゲーションで2 kbpが作られたのかなと思いますが、確かにおおさまのPCRの時点でのmis annealingで間にGGGを持つアンプリコン（ 2 kpb）は生じる可能性はありますね。 勉強になりました。今後、末端の数塩基はミスマッチになるようにしたいと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5546-10 - 2016/11/12 (土) 11:42:22 - おお まずタンデムには入らないので、インサートを得るときのPCRも疑ったほうがいいです。サイズがあっていてもミスアニーリングのバイプロダクとなどが混じって邪魔しているかもしれませんので。 GGGはプライマー由来でしょう。両方のプライマーの末端がりょうほうGGGなのでそこからミスアニーリングが起こる可能性はあります。とくにGGG-BamHI までが全く同じ配列なので余計にです。片方をGCGにするとか工夫したほうがいいかと思います。４つ余分に付ける人で一方をGCGCにして他方をGGCCとかCCGGにする人もいるようです。 私はしょっちゅう一つの酵素だけつかって末端を切ってライゲーションして、タンデムに入ったことはほとんどなく入っても過剰（プラスミドの１００倍以上とか）にライゲーションした時数％あったくらいです。

(無題) 削除/引用 No.5546-9 - 2016/11/12 (土) 11:24:26 - しろ Pme1でカットしてみました。 するとやはりタンデムに入っていたのか2kbpほどのバンドが出現しました。 GGGの3塩基はなぞで仕方ありませんが。。 やはりクローニングはダブルダイジェッションが基本でしょうか？ 昔はシングルでクローニングするように言われていました。（あとで切り出して元のベクタとして復元出来ることをメリットとして） ですが、そんなメリットは必要ないですよね。今回は他の理由でシングルクローニングでしたが、今後はできるだけ避けようという気になりました。みなさまありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5546-8 - 2016/11/11 (金) 12:21:09 - しろ 774R様、ありがとうございます。 >シーケンスの件はなんとなくわかったかも。 >インサート内のプライマーを使ってシーケンスをしたときに、2つの波形が重なるとのこと。 設計通りの配列で読まれたほうは、タンデムの後ろのインサートにアニールして伸長したシグナル。おかしいピークは、タンデムの前インサートにアニールして伸長したシグナル。 はい、そのように私も解釈しており、タンデムにちがいない！とまで確信していました。 774R様もタンデムで入った経験お持ちなのですね。そうですね、大外でまずは切ってみます。ありがとうございます。 > ただし、もしタンデムで入ったとしたら以下の配列はおかしいですよね？ > > >BamH1- kozak - ATG --(1 bp)-- TAA - BamH1 -GGG - BamH1 - kozak - ATG -- > > ではなく、 > > BamH1- kozak - ATG --(1 bp)-- TAA - BamH1 - kozak - ATG -- > のようになるのではないでしょうか？ > 「BamH1 -GGG - BamH1」のような配列が生じる理由が見当付きません。 そうなんですよー＞＜＞＜＞＜。GGGってなんで入るの？とここだけがどうしても理解できないんです。。。。

(無題) 削除/引用 No.5546-7 - 2016/11/11 (金) 12:17:56 - しろ > それならその結果を信じる限りはタンデムに入っている可能性はないのでは？ほんとにタンデムに入っていたらベクターから読んでも３’がわのBamHIからまた配列が繰り返して見られますよね。 > > んってかインサート１kbpだから届かないのか。。。え、でも待ってよ予想通りのピークになるって書いてるし。。。 ---> - BamH1 - kozak - ATG --(1 kbp)-- TAA - BamH1 - vector配列 - BamH1 - kozak - ATG --(1 kbp)-- TAA - BamH1 - GGG - BamH1 - kozak - ATG --(1kbp) ------------------------------------------- 1kbp内に設計したプライマーを使って読むと、この下線部↑でダブルピークになります。 ですが、vector内に設計したリバースプライマーではシングルピークです。（以下） <--- - BamH1 - kozak - ATG --(1 kbp)-- TAA - BamH1 - vector配列 vector内に設計したリバースプライマーでは、不思議なGGGまでは届かないので、タンデムになっているかどうかはわかりません。 んんー何が起きているんだー＞＜。

(無題) 削除/引用 No.5546-6 - 2016/11/11 (金) 12:04:21 - 774R シーケンスの件はなんとなくわかったかも。 インサート内のプライマーを使ってシーケンスをしたときに、2つの波形が重なるとのこと。 設計通りの配列で読まれたほうは、タンデムの後ろのインサートにアニールして伸長したシグナル。 おかしいピークは、タンデムの前インサートにアニールして伸長したシグナル。 但し、前にも書いた通り、BamHIで連結してるはずであれば、連結部分の配列は、 「 --(1 bp)-- TAA - BamH1 - kozak - ATG --」 となるはずで、なぜにGGGが入るのか分かりませんので謎は残ります。

(無題) 削除/引用 No.5546-5 - 2016/11/11 (金) 11:58:56 - 774R 私も同じくBamHI-BamHIでPCR産物をクローニングしたときに、タンデムで入った経験ありです。BamHIで切っても正しいサイズのバンドが出るので発覚するのに時間がかかりました。おおさんが指摘してる通り、大外で切ることをお勧めします。 ただし、もしタンデムで入ったとしたら以下の配列はおかしいですよね？ >BamH1- kozak - ATG --(1 bp)-- TAA - BamH1 -GGG - BamH1 - kozak - ATG -- ではなく、 BamH1- kozak - ATG --(1 bp)-- TAA - BamH1 - kozak - ATG -- のようになるのではないでしょうか？ 「BamH1 -GGG - BamH1」のような配列が生じる理由が見当付きません。

(無題) 削除/引用 No.5546-4 - 2016/11/11 (金) 11:36:59 - おお >> ベクターにあるプライマー配列からシーケンスしてみるというのもやってみたらいいかと思います。 >それは実は行っていて、それだときれいに予想通りの配列を持ったシングルピークになるんですよね。 それならその結果を信じる限りはタンデムに入っている可能性はないのでは？ほんとにタンデムに入っていたらベクターから読んでも３’がわのBamHIからまた配列が繰り返して見られますよね。 んってかインサート１kbpだから届かないのか。。。え、でも待ってよ予想通りのピークになるって書いてるし。。。

(無題) 削除/引用 No.5546-3 - 2016/11/11 (金) 11:21:56 - しろ おお様、 書き方が悪かったのですが、シークエンスに使用したシークエンスプライマーは1kbp内に設計したプライマーで読んでいます。このプライマーは20bpほどの長さです。 > プライマーのミスアニーリング出できたものを読んでるような気がします。サイズもタンデムに入っているには中途半端ですし、極稀にしか（インサートの量にもよるけど）入りませんから。 この中途半端というのはどういった意味でしょうか？ そしてタンデムに入るのは極稀なんですね、、ベクターインサート比も1：1程度でしたのでめちゃくちゃ多いということはないと思います。 > BamHIより外側にある制限酵素で切り出してサイズを確かめるのと、 それは良いアイデアですね！Pme1でごっそり切り出して確認してみることにします。 > ベクターにあるプライマー配列からシーケンスしてみるというのもやってみたらいいかと思います。 それは実は行っていて、それだときれいに予想通りの配列を持ったシングルピークになるんですよね。。。ですからそういうのもあってタンデムに入っているのかなと思っていました。 > カッコないは１bp？ ごめんなさい、1kbpです。 > BamH1- kozak - ATG　この部分が読めるんですか？ 上述の通り、クローニングに用いたプライマーではなく、シークエンスプライマーでシークエンスしているので、読めています。 んんんー。タンデムに違いないと思っていただけに、そうでないとすればどう解釈すればいいのか困ってしまいますね。まずは切り出してサイズを確認するところからやってみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.5546-2 - 2016/11/11 (金) 10:59:41 - おお プライマーのミスアニーリング出できたものを読んでるような気がします。サイズもタンデムに入っているには中途半端ですし、極稀にしか（インサートの量にもよるけど）入りませんから。5'- GGG - BamH1 - kozak - ATG (以下20 bp) - 3'という長いプライマーを使ってますのでそういうのも要因かもしれません。 BamHIより外側にある制限酵素で切り出してサイズを確かめるのと、ベクターにあるプライマー配列からシーケンスしてみるというのもやってみたらいいかと思います。 ん5'- GGG - BamH1 - kozak - ATG (以下20 bp) - 3'でシーケンスして、なんで ＞予想通りの正しいピーク ＞BamH1- kozak - ATG この部分が読めるんですか？ また BamH1- kozak - ATG --(1 bp)-- TAA - BamH1 -以下ベクターの配列 カッコないは１bp？

BamH1サイトへの1kbのクローニングについて 削除/引用 No.5546-1 - 2016/11/11 (金) 10:01:34 - しろ 大変初歩的な内容なのですが、解釈に困っておりお助けいただけないでしょうか。 私は両端にBamH1サイトを付けた1kbほどのPCR断片を、pcDNA3.1(+)のBamH1へクローニングしています。 ベクターはきちんと脱リン酸化処理を行い、cPCRで目的のサイズのアンプリコンを持つコロニーからミニプレップして、シークエンスチェックというところに来ています。 これまで一つの制限酵素認識サイトにクローニングということは遇えて行って来なかったので、今自分が直面する不思議な現象がコモンなのか、そうでないのかわかりませんので、ここで質問させていただきました。問題は、シークエンスは最後の直前まで読めているのですが、最後のBamH1以降がダブルピークになっています。個々の塩基を目で追い、配列を書き出してみると驚きました。まずその前に実験の詳しい条件ですが、 フォワードプライマー (ATG = start codon) 5'- GGG - BamH1 - kozak - ATG (以下20 bp) - 3' リバースプライマー (TAA = stop codon) 5'- GGG - BamH1 - TTA (以上20 bp) - 3' PCR amplicon 5' - GGG - BamH1 - kozak - ATG --(1 bp)-- TAA - BamH1 - CCC - 3' BamH1で処理したPCR断片 5’- BamH1- kozak - ATG --(1 bp)-- TAA - BamH1 -3' となります。 cPCRのプライマーのフォワードプライマーは1bp内に設計しており、リバースプライマーはベクター内に設計しています。cPCRのアンプリコンサイズは650bpです。 cPCRの結果も不思議なのですが、20コロニーをPCRさせると、5つ、650bpのコロニーを拾えたのですが、8つが1650bpほどのPCRサイズを示すコロニーがありました。 そこで5つのコロニーからミニプレップ産物をシークエンス（この際、cPCRと同じフォワードプライマーを使用しました。）すると、3'端のBamH1以降はベクターの配列になるはずが、ダブルピークになっており、以下のような予想通りの正しいピークと、おかしなピークがオーバーレイされていました。 予想通りの正しいピーク BamH1- kozak - ATG --(1 bp)-- TAA - BamH1 -以下ベクターの配列 おかしなピークを目で読むと、、 BamH1- kozak - ATG --(1 bp)-- TAA - BamH1 -GGG - BamH1 - kozak - ATG -- でした。 cPCRの結果が650と1650のバンドの２通りがあるので、ひょっとしたらタンデムにクローニングされてしまったのでは？と考えていますが、それでもなぜこのような不思議なつなぎ合わせが生じてしまったのか興味深いといいますか、不思議でなりません。 何が起きているのでしょうか？ 非常にわかりずらい内容で恐縮しておりますが、宜しくお願いします。

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