TK-1様、早速アドバイスありがとうございます。
@還流固定は、縦隔リンパ節などをFlow cytometryで評価するため、行いませんでした。
先にリンパ節を採取してから還流固定も検討しましたが、Qualityが良い大動脈RNAを回収するため、こちらを最優先しました。（harvest含めて心停止から5分以内を目指して採取、-80℃の液体窒素で凍結）
A空気を抜くのは、鑷子を用いて念入りに行っていましたが、心臓を把持・圧迫するデメリットの方が大きかったかもしれません。出来れば、左室心筋の病理評価も行いたいので、TK-1様の仰るとおり、評価しない右心系の組織はばっさり切り落とし、左室は血管と別に凍結したいと思います。
大動脈周囲の支持組織がすくないと、血管内にOCTがあっても内腔がcollapseしてしまうかもしれないので、ある程度組織を残してトリミングしたいと思います。
確かにトリミングの量が減れば、時間も短縮できますし、刃の保ちも良くなりそうですね。
温度が低すぎた場合、他のトピックにもあったように指の腹で少し暖めてみます。
非常に参考になりました。ありがとうございました。
>[Re:2] TK-1さんは書きました :
> > 1. マウス安楽死で、心採血後に心尖部よりPBSで還流、右心房から脱血
> > 2. マウス心尖部を短軸で切断
> > 3. 4%PFA 4℃で24hr以上固定
> そのまま還流固定できないんですか？
>
> > 4. 20%スクロース(PBS) 4℃ 沈殿するまで
> > 5. 30%スクロール(PBS) 4℃ 沈殿するまで
> > 6. 心臓内腔と外面のスクロースをキムワイプで拭う
> > 7. OCTコンパウンドにつけて、内腔に空気がなくなるまで浸す
> OCTコンパウンドは粘性がある程度あるから、これでちゃんと空気をとりのぞけるんですかね？直接心臓内腔にOCTコンパウンドを注入するほうがいいかと思いますが。それか、弁の位置より下方の心室はいらないんなら切り落としてしまう。それの方が切片を切る時も過剰なトリミングはいらない。
>
> > 8. クリオモルド2号内で、心尖部を底にして、OCTコンパウンドでイソペンタンを介して液体窒素で凍結 -80℃保存
> > 9. クライオトーム内の温度を-20℃に設定して、凍結ブロックを30分-60分程度放置
> > 10. 荒削り用の刃で面だし(15-20μm)、薄切用の新しい刃に替えて薄切(5μm)
>
>
> > うまくいかない点は、
> > @サンプルが刃と平行に崩れてしまう。ばさばさした印象。
> 温度が低すぎ
>
> > Aサンプル全体が切った方向に潰れてしまう。心臓・血管含めて楕円形になる。
> 内腔にきっちりとOCTコンパウンドが入ってないからでしょう。
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