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(無題) 削除/引用 No.5542-5 - 2016/11/14 (月) 22:49:14 - ふちふち お返事が遅くなりました。 ホモジナイズ後に尿素を加えることで溶解出来ました。 現在、尿素の濃度を調整中です。 ご協力感謝いたします。

(無題) 削除/引用 No.5542-4 - 2016/11/10 (木) 16:51:53 - ふみ 同じキットではないですが、タンパク質のペレットが全然溶けなくて困ったことがあります。 ソニケーションしてもビーズホモジナイザーを使っても駄目でした。 そのときは、尿素(7M), CHAPAS, Triton X-100入りの可溶化バッファーで溶かしたあとに、2xサンプルバッファ(還元剤入り)で2倍希釈しました。

(無題) 削除/引用 No.5542-3 - 2016/11/10 (木) 16:32:56 - おお かなりアグっているんだとおもいます。粗ニケーションもてですね。あとはグラスビーズを入れてボルテックスするか。または６M尿素で溶解する手もありかと。尿素をつかうとボイルを避けるべきですが（するとカルバミル化がおこるので）、３７度で数分置いとけば何とか解けることも多いです。サンプルバッファーにの２ーMEの代わりにDTTをつかうか、２ーME入りのものでいいからさらにDTTを加えるなどして、ボイルを避けても十分なS-S結合の切断ができるようにするとより良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.5542-2 - 2016/11/10 (木) 15:56:01 - exp sonicationを試してみてはいかがでしょうか？

キアゲンのMiniキットで抽出したタンパクのペレットを溶かす方法 削除/引用 No.5542-1 - 2016/11/10 (木) 15:51:02 - ふちふち キアゲンのAllPrep DNA/RNA/Protein Mini キットを使って DNAとタンパクの抽出を行っています。 DNAはライセート、タンパクはペレットとして抽出出来ました。 抽出したタンパクはBCA法で定量した後、ウェスタンブロットに使うことを考えていているため、ペレット状のタンパクの溶解を試みているのですが、 プロトコル通りペレットに5%SDSを加えて撹拌しても溶解しません。 1.5mlチューブギリギリまで10%SDSを加えて、ボルテックスミキサーにかけてもダメでした。 使用しているキットとは別の会社になりますが、GEヘルスケアさんのサイトには1.0gのタンパクペレットは1.4ｇのSDSで完全に溶解するとの記述を見つけました。 6週齢マウスの両側の海馬から抽出したタンパクであり、抽出したタンパクの量はそこまで多いとは思えないのですが・・・。 同様のキットを用いてタンパク抽出を行っている方でペレットの溶解に成功された方が居られましたら、その方法等教えていただけないでしょうか。 上記あるいは上記以外でペレットの溶解に何か良い方法がありましたらそちらも併せてご教授ください。

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