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(無題) 削除/引用 No.5530-8 - 2016/11/15 (火) 05:29:54 - てれ >きゃりあー様 TNF-aに関してはキャリアタンパクの存在がクリティカルなのですね。勉強になります。 BSA濃度を0-5%までふって実験をしてみた所、0%の場合に明らかにVWFの分泌が弱いという結果が得られました。濃度依存性については3%以上が良さそうな結果も同時に得ています。 キャリアタンパクとしての役割なのかブロッキング効果なのかまでは特定していませんが、BSAの添加によって実験条件が改善できました。 皆様ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5530-7 - 2016/11/09 (水) 03:37:48 - きゃりあー >きゃりあー様のコメントで気づきましたが、実験中はSerum-free mediumを使用していました。十分なキャリアタンパクがない状態でTNF-aがすぐに失活してしまっていた可能性が高いかもしれません。 うちのラボで起こった問題がまさにTNF-aでした。R&Dのキャリアフリーのものを買って、以前はPBS + 0.1% BSAで溶解していたものを、新人がPBSのみで溶解してストック溶液を作った為、TNF-aが効かなくなったと騒ぎになりました。

(無題) 削除/引用 No.5530-6 - 2016/11/09 (水) 03:11:19 - てれ 皆様早速のご助言ありがとうございます。 追加情報ですが、刺激に用いているのはTNF-aです。 >774r様 実験デザイン上、プラスチックキャピラリー上で培養を行っているので通常のdishよりもwashの効率が悪く死細胞のゴミなど完全に除く事ができないサンプルもあります。そのような状況では非特異的に吸着してしまう可能性はあるかもしれません。 >きゃりあー様 きゃりあー様のコメントで気づきましたが、実験中はSerum-free mediumを使用していました。十分なキャリアタンパクがない状態でTNF-aがすぐに失活してしまっていた可能性が高いかもしれません。 >おお様 文献も提示してくださり有難うございます。 BSAは脱脂されたものを使用しています。 感受性の促進については不明ですが、少なくともBSA単体ではVWFの分泌は起こらない事は確認しています。そのため、BSAが細胞に刺激を与えている可能性は低いと考えています。 再度実験を行い結果を後日報告させていただきたいと思います。 有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.5530-5 - 2016/11/08 (火) 13:09:35 - おお However, one report (ATVB 11:1944, 2009) suggested that SFA-induced TLR activation in cell culture systems is due to contaminants in BSA used for conjugating fatty acids. fasebj.org/content/26/1_Supplement/364.8.short Albumin preparations may contain variable amounts of contaminants (26), biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2015/May/In-vitro-use-of-free-fatty-acids-bound-to-albumin-A-comparison-of-protocols/biotechniques-358331.html?service=print ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2860567/ また、お使いのBSAは脱脂されてますでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5530-4 - 2016/11/08 (火) 12:54:44 - おお BSAに混じっていた血清成分が、その刺激による感受性を高めていたり、直接分泌を促進したりしている可能性は否定できますか？

(無題) 削除/引用 No.5530-3 - 2016/11/08 (火) 08:23:43 - きゃりあー 刺激に使う試薬がキャリアフリーのやつなのにキャリアーを入れずに実験してた、とか無いですか？

ぶろっきんぐこうか？ 削除/引用 No.5530-2 - 2016/11/08 (火) 07:56:39 - 774r 何かに非特異に吸着して失われてた分がちゃんと回収できるようになったとか？

細胞刺激時のBSA添加 削除/引用 No.5530-1 - 2016/11/08 (火) 07:10:32 - てれ いつも皆様のディスカッションから学ばせて頂いております。 私は現在、ヒト血管内皮細胞HUVECを刺激しVWFが分泌される様子をICCで観察しています。 実験条件を検討する中で、たまたま刺激用のmeidumに5% BSAを加えて実験した所、加えない時と比較して明らかにVWFの分泌が増加していました。 そこで質問なのですが、このように細胞を刺激する際にbufferやmediumにBSAを加えることで反応を促進するような事は考えられるでしょうか。

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