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(無題) 削除/引用 No.553-5 - 2012/05/23 (水) 18:47:53 - Flow-Joe pre-clearなどもして得られた分子をどのようにして特異、非特異と判断しているのでしょうか。 タグをタンデムにしたところで解決される問題なのでしょうか。 うさん ＞二段階以上を考えないと非特異を消す努力は徒労に終わると思います。 どのような理屈でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.553-4 - 2012/05/23 (水) 17:19:19 - う 現実問題として、免疫沈降のワンステップでは無理だと思います。 このごろ見た論文で行なわれていた実験は、 Flag tagとHA tagを両方持ったfusionで Flagペプチドで精製、その精製溶液を HA tag抗体で落として、HAペプチドで精製 その産物を銀染色でした。 他の方も挙げられていますが、二段階以上を考えないと 非特異を消す努力は徒労に終わると思います。

(無題) 削除/引用 No.553-3 - 2012/05/23 (水) 17:10:21 - ~ IPで非特異結合が完全に消えることは無いと思いますが。 コントロールベクターを導入したHeLa細胞でdynabeads-抗FLAG抗体でIPした場合、落ちてくるものはあるのでしょうか？ それと並べて泳動して差を見ることで、特異的な結合をしているものを得ることができるのではないでしょうか。 また、抗FLAG抗体のFc部分に結合するタンパク質であれば、dynabeads-control IgGで除くことができるかもしれませんね。

Tandem Affinity Purification 削除/引用 No.553-2 - 2012/05/23 (水) 16:17:19 - 挽きたて プロテオーム解析時に、非特異的吸着を減らすためにTandem_Affinity_Purification法が開発されました。 http://en.wikipedia.org/wiki/Tandem_Affinity_Purification いろいろなTagを組み合わせのベクターが販売もされています。

免疫沈降での非特異的吸着 削除/引用 No.553-1 - 2012/05/23 (水) 15:01:53 - GENE いつも参考にさせていただいております。 現在、HelaでFLAGタグ融合蛋白質を強制発現させ、抗FLAGタグ抗体を用いて免疫沈降を行い、結合蛋白質をマスで解析しようとしています。 FLAGタグ融合蛋白質は高分子量のタンパク質であるため、発現量が低かったですが、免疫沈降後の銀染色で確認はできました。 ただ、非特異的蛋白質が多く、特異的に結合している蛋白質がはっきりしません。 非特異的吸着を減らすように、 ・dynabeadsの使用 ・dynabeadsのBSAでの処理 ・pre-clear処理 ・洗浄回数を増やす ・FLAGペプチドで溶出 を行いましたが、どうしても非特異的蛋白質のバンドがラダーに見られます。 FLAGタグ融合蛋白質の発現量が高ければ（回収量が高ければ）、いいのですが、これもうまくいっていません。 何かほかに、免疫沈降で非特異的蛋白質を除く方法がありますでしょうか？ それとも、ある程度の非特異的蛋白質は消えないのでしょうか？

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