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(無題) 削除/引用 No.553-26 - 2012/05/30 (水) 01:16:35 - *:*# 材料HeLa ＆マスもOKの環境なら、自分的にはこれはもう同位体標識して定量的プロテオミクスで片付けることを考える。コンタミのバックグラウンドけっこうあっても、よっぽどひどくなければいける、たぶんいける。IPの精製度の悪さをそんなに気に病む必要もなり、より有益な労力の時間配分のためにもなる。 むしろ心配なのはそのあと。IPの精製度を上げたいとおもうあまり、せっかく捕まえた弱いインターラクションしてる重要な分子を、気合い入れすぎた精製でどんどん失っていってしまうこと。 もうひとつは、そもそもFlag-tagで強制発現だから、インターラクションしてるものが、生理的な相互作用なのか、強制発現した変な蛋白質ということに起因するインターラクションなのかという問題。つまりこの段階では同定された蛋白質はあくまで可能性のある候補にすぎない（potential targetsとかそういやつ）。よって同定された個々の蛋白質について内在性蛋白質でバリデーション取って行かないといけないわけだがこれがかなり面倒。現実問題としてもちろん全部しろとは言われないと思うが、すくなくともディスカッションで取り上げるような分子はしておかないと、（bona fade targetsとかの言葉使える分子でないと）レビュアー的には、これだいじょうぶかなあ---、という気分になるようにおもう。

(無題) 削除/引用 No.553-25 - 2012/05/26 (土) 14:33:23 - 挽きたて 参考になるかも。 http://www.biotechniques.com/rapiddispatches/Improved-methodology-for-the-affinity-isolation-of-human-protein-complexes-expressed-at-near-endogenous-levels/biotechniques-330982.html

(無題) 削除/引用 No.553-24 - 2012/05/25 (金) 14:31:48 - 挽きたて 追加です。洗浄を強くすると相互作用の弱いものは外れるので、ご注意を。 抗体から目的タンパクが外れる(収率が落ちる）可能性も考慮してください。 そのため、温和な条件(peptide,biotin,EDTA等）で溶出するTandem_Affinity_Purification法は、未知の相互作用パートナーを探すのに適しています(この辺は興味をもってご自分で勉強してほしかったので、あえて初めに出しませんでした）。

(無題) 削除/引用 No.553-23 - 2012/05/25 (金) 13:05:31 - 挽きたて 磁気ビーズの経験は少ないので参考程度に(主観・想像も含めて）。 preclearの回数を増やす：費用対効果から諦めることが多い。 結合時の塩濃度を変える；収率が上がったことがあった。 洗浄回数を増やす：純度はあまり上がらないことが多い。ビーズを少しずつ失うこともあり、たっぷりの洗浄液で5回程度にすることが多い。 洗浄液組成：＋0.5M NaCl：純度はあまり上がらないことが多い。＋5~10% glycerol：純度はあまり上がらないことが多い。TritonX100+X102を各0.05%添加：純度が上がったことがあった。 Betaineやクエン酸添加の効果が気になる。Arginine添加：試したことはないが効果があるらしい。 抗原ペプチドによる溶出：純度を上げる効果が一番高いが、収率が低い（外れないものもある）ことがある。高価。

(無題) 削除/引用 No.553-21 - 2012/05/25 (金) 12:00:21 - 挽きたて Flow-Joeさんは、いろいろな方法を提示されて回答者が優先順位に悩むのでは？心配されているのでしょうね。 私は、「回答者はそこまで責任を負わない」と思っていますがいかがでしょうか。 (質問者から優先順位について問い合わせがあれば出来る範囲でお答えしますが、どちらにしろ最終的な責任は取れませんし） また「主観」と「客観」と仰っていますが、どのように区別しているのでしょうか。 タンパクの実験手法なんて、全く同じ系（目的タンパクの種類、タグ抗体ロット、チューブ製品等も含む）で行っていない限り、回答に関しては主観(知識？知恵？）・自分の経験の演繹しかあり得ないと思っています。皆さんはその中の最大公約数的な普遍的な部分を回答しているではないでしょうか＝「客観」？。Tandem_Affinity_Purification法も沢山の論文がありますので、自分以外の結果＝客観という意味でも該当すると思います。私は良い結果が得られた経験もあり質問者の参考になればと思って提示しました。 さらに「奥が深い」（＝試行錯誤・経験が必要？）とかは関係ないでしょう。「奥が浅い」＝簡単な方が応用や普及が容易ですので、優れていると思うのは私だけかな？ （Flow-Joeさん、これに関してはご回答は不要です。読み流してください。）

(無題) 削除/引用 No.553-20 - 2012/05/25 (金) 11:55:19 - はぁ ＞攻撃的な文章で気分を害されるとは思いましたが、あえて書き込んだのは。 そんなん書き込むのやめようよ。まぁもうすでに大人の方から引かれているけどね・・・。あんたが大将。

(無題) 削除/引用 No.553-19 - 2012/05/25 (金) 11:27:18 - う 私が間違ってました。 申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.553-18 - 2012/05/25 (金) 11:23:59 - Flow-Joe ＞いろいろな方法があるという情報を提供して質問者様の判断を仰ぐ で全く問題はないと思います。 攻撃的な文章で気分を害されるとは思いましたが、あえて書き込んだのは。 ＞現実問題として、免疫沈降のワンステップでは無理だと思います。 という文章が、タンデムタグを使わないと無理だと限定している様な印象をうけたからです。 駆け出しの研究者もいるでしょうから、主観は主観として書かなければならないと思います。 ある方法を用いると、どういう理屈で非特異的吸着が防げるという回答が必要最小限の情報だと思います。 また、 ＞理屈ではなく経験です。 とうい文章も気になりました。 Tandem_Affinity_Purification法はそんなに奥が深いものではありません。 自分と意見が違うのでしつこく書き込んでるのではなく、主観と客観がハッキリしないのでミスリーディングだと思ったからです。

(無題) 削除/引用 No.553-17 - 2012/05/25 (金) 10:34:46 - う 間違いかどうかを論じる必要性は無いと思います。 いろいろな方法があるという情報を提供して質問者様の判断を仰ぐ、 回答者は、それだけではないかと。 あと、詳細が気になる回答者と質問者のやり取りであって、 自分と違う意見の回答者が、正解なんてないことで どっちが正しいとか正しくないとか、 質問者を差し置いて議論するのは、どうかと思います。 あと、そこまで頭ごなしに否定される筋合いは無いです。 あまり気分がいいことではないと、わかりませんか？ 自重しましょう。

(無題) 削除/引用 No.553-16 - 2012/05/25 (金) 10:16:42 - 院生 どっちが大変かなんて議論する暇があるなら 両方やればいいじゃないですかね？？ ベクターなんて1週間あれば作れるでしょ。

(無題) 削除/引用 No.553-15 - 2012/05/25 (金) 09:30:15 - GENE みなさま、親身になっていただき本当にありがとうございます。 みなさまの意見を参考にさせていただき、 ・発現量（フォールディングが正しいと思われるもの）を増やす。 ・2段階の精製を行う。 ・ネガコンをコントロールベクターを導入したHeLa細胞でdynabeads-抗FLAG抗体で行う。 を検討したいと思います。他にもあればご助言いただければ幸いです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.553-14 - 2012/05/25 (金) 09:28:25 - Flow-Joe はっきり申し上げますと。 >二段階以上を考えないと 非特異を消す努力は徒労に終わると思います。 というのが大きな間違いといいたいのです。

(無題) 削除/引用 No.553-13 - 2012/05/25 (金) 00:24:13 - う 私にはネガコンも汚ないとは読み取れません。 また、いきなりタンデムを勧めるのはどうかとおっしゃいますが シングルで何かをいじる努力を勧めることと、タンデムに取り掛かること 結果として、どちらが(どういう結果になるとしても)簡単かは その人次第だと思います。 なので、私はFlow-Joe様が何がお気に召さないのかわかりませんが、 どっちがどうとか意見を、私に求められても、それは違うのではないかと。 前提として、タンパク質をマスで同定しようとしている質問者様に対して、 免沈の条件がどうとか、サンプル調整がどうとか、 Flow-Joe様のように疑ってかかる必要はないのではとは思っています。 そんな大それた実験を実行しようとしている質問者様なので、 私達と同様かそれ以上の見識を持った方であるという前提で私は 話しているという意味です。 一応、質問者様は特異性をあげる努力は普通にしているわけですし。 質問者様はそういう方だという前提と、 これまで散々相互作用するタンパク質同定したいと (皆行き着くところはそういう実験かと)やってきた経験から、 先の書き込みをしたまでです。 質問者様が、そもそも免沈すら私のような普通の人に指摘されるような 初歩のことに改善点が必要な方であるとしたら、 私にはアドバイスしようがありませんので。 これ以上は荒れるので、質問者様と議論されてください。

クロスリンカー 削除/引用 No.553-12 - 2012/05/24 (木) 18:58:31 - 挽きたて もう一つ、細胞のままDSPなどのクロスリンカーを用いて複合体を安定化し、免沈での洗浄を厳しくするのはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.553-11 - 2012/05/24 (木) 18:55:58 - 挽きたて Flow-Joeさんの意見を踏まえて、もう一度GENEさんの質問を「注意深く」読んでみました。 確かにピントがずれているかな。このままでは失礼なので、強引にあら探しして.... ネガコンの問題以外に「FLAGタグ融合蛋白質を強制発現」とありますね。一過性発現でしょうか？そうだとすると、(分子量が大きいとのことなので）過剰発現のせいで正常にfoldingしていないタンパクが含まれている可能性もありそうです。あるいは抽出条件によっては変性したタンパクが生じている可能性とか（特に膜タンパクに多い）。と、言ってみても変性しているかどうかの確認は楽ではないですね。 ポリユビキチン化されていないかMG132処理して調べてみるとか？シャペロン分子がベタベタくっついていないか調べるとか。（ただしhsp90の有無の意義を判断するのは難しいです：不活性型に結合していることもありますので。） 出来るかどうか知りませんが、CDスペクトル解析やpreparative SPRで解離の様子を観ながら回収するとか？ さらに無責任ですが、強さの異なる数種のpromoterを利用して安定発現細胞を作製した方が早道かもしれません。 このあたりの方法論に王道はなさそうなので、かなり具体的な条件が提示されてもこんなモンかな？私もどなたか教えてほしいです....

(無題) 削除/引用 No.553-10 - 2012/05/24 (木) 17:24:27 - Flow-Joe 2段階精製もビーズやタグに結合する非特異的分子を除くには理にかなっていると思います。 しかし、GENEさんの情報によると ネガコンはFLAGtag/bateをisotypecontrolで行っている。 ＞ネガコンに比べて、サンプル（抗FLAGタグ抗体使用）ではFLAGタグ融合蛋白質の分子量あたりの位置にバンドが見られる。 ＞非特異的蛋白質のバンドがラダーに見られます。 ということはネガコンも汚いと私は解釈しました。 いきなりTandem_Affinity_Purification法を薦めるのはミスリーディングな気がします。 sepharoseやagaroseではなくdynabeadsを用いている点から考えるとIPの可溶化条件などのサンプル調製に問題がありそうな気がします。上記のネガコンでノンスペが多いようだとco-IPされたものの信頼性はたとえ、タンデムタグを用いても低いと思います。Bateに非特異的にくっついている可能性の方が高そうだからです。 また、transgenic mouseをつかっているわけでもないようなので、タグのみを発現させたものを抗タグでIPするコントロールが何よりも必要な気がします。 うさん、挽きたてさんいかがでしょうか。ご意見を伺えれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.553-9 - 2012/05/24 (木) 10:29:57 - 挽きたて うさんの意見に賛成です。 2段階のAffinity_Purificationを行なう場合、ビーズの基質表面の性質が異なるものを使用すると非特異的吸着物がさらに減ります。例えば、アガロースビーズとマグネットビーズ等。理屈は簡単で非特異的吸着する物質がお互い異なるからです。 特異的なものをいかに効率的に抽出するかを極めたProteome研究手法は、とても参考になりますよ。

(無題) 削除/引用 No.553-8 - 2012/05/24 (木) 09:30:04 - ~ >ネガコンとしては、FLAGタグ融合蛋白質を強制発現させたHelaで、normal IgGで免疫沈降しています。 これが出来ているのであれば、後は画像処理で対応できるのではないでしょうか。 ベクターから作り直すより、ラボで一番大きなゲル板でゲルを作るほうが、時間は短くて済むと思います。 ただ、気になるのは、FLAGタグ融合蛋白質は銀染色で無いと見えないくらい量が少ないのでしょうか？ そうであれば、モル数としてはFLAGタグ融合タンパク質よりも少ないであろう共沈してくるタンパク質は、銀染色でも見えない可能性も十分考えられるのではないでしょうか。 非特異を含めてたくさんのバンドが出ているのでそちらに注目してしまうのでしょうけれども、 この後、そのタンパク質の機能につなげて行く際には、今の段階での取りこぼしを減らすようにデザインした方が、安心して勧められると思いますが。

(無題) 削除/引用 No.553-7 - 2012/05/24 (木) 09:04:52 - う Flow-Joe様 理屈ではなく経験です。 すべて書くのは面倒ですが、よほど特殊な方法でもない限り、ほとんどの研究者は 非特異が出て時に対処する方法というのは同じかと思います。 それらを行なって頭で考えた理屈通りにドラスティックに改善が見られたことが 全くと言っていい程、無かったからです。 勘ぐるならば、ワンステップでは改善が見られないと思った人々が、 ツーステップ以上のやり方を構築し、それを行なった論文が 一昔前のクローニング論文のように、相互作用するタンパク質を見つけたという 良いジャーナルにアクセプトされる一因ではないかと思うくらいです。 答えになっていないかもしれませんが、そういうことです。 どう思われるでしょうか？違う経験があれば教えていただきたいです。 私は理屈はある程度の研究者なら思いつくと思いますが、 結局その通りになるかどうかわからないということが多いとみんな思っていると思うので、 経験を言うことの方がいいと思い、前の書き込みをしました。 非常に有効な手段があったらここで書き込みたいですし、 他の方であったら教えていただきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.553-6 - 2012/05/23 (水) 18:59:56 - GENE みなさま、ご返答ありがとうございます。 ネガコンとしては、FLAGタグ融合蛋白質を強制発現させたHelaで、normal IgGで免疫沈降しています。ネガコンに比べて、サンプル（抗FLAGタグ抗体使用）ではFLAGタグ融合蛋白質の分子量あたりの位置にバンドが見られる（銀染色）ので、免疫沈降はできていると考えています。 ２つのタグを使う方法もあるのですね。勉強になります。詳しく調べてみます。

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