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(無題) 削除/引用 No.5529-13 - 2016/11/15 (火) 07:01:25 - あるタンパク質 精製標品であり、あるタンパク質と書かれていることから、測定するタンパク質の種類は同じであると読み取りましたが。 もしタンパク質の種類の間でバラつくならそう書くはずです。（頭がちゃんとしてればの話ですが）

(無題) 削除/引用 No.5529-12 - 2016/11/15 (火) 03:22:25 - おお >BCA法では測定結果が安定するのに対して、A280ではブレがかなり大きいです。 このブレはもしかしたらBCAの結果に対して開きがあるということでしょうか？たていすさんの指摘のようにA280はチロシンなどのアミノ酸組成比に大きく左右されます。BSAをスタンダードにするよりは、 extinction coefficient を使うほうがいいかと思います。理論値を計算してくれるWEB上のソフトなどありますので探してみると良いでしょう。ただS-S結合も２８０nmの吸収に影響があるようですが、、、そのへんで実際の量と差が出るかもしれません、

(無題) 削除/引用 No.5529-11 - 2016/11/14 (月) 18:11:26 - たていす ＞タンパク質はある生物の分泌物中に産生させたリコンビナントのものです。 これを最初に言っておけば、「そのタンパク質のアミノ酸配列中に、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンはどのくらい含まれるのか」と聞いたことでしょう。 これらのアミノ酸含量が全て低いと、280nmで測定することは事実上不可能です。

(無題) 削除/引用 No.5529-10 - 2016/11/14 (月) 14:45:40 - おお >抽出時にのみTritonを使用しましたが、最終産物にはほとんど残留してないかと思われます。 この過程を詳しく教えてきただけませんか。 一度蛋白についたデタージェントは取れにくいという話も聞いたことがあありますが、、、それについてはあまり経験もありませんしどのように影響するかわかりません。 また核酸の可能性はないということですが、核酸以外にもいろいろなものがコファクターになりえるので、なにかついてきているとか、たまたま同じフラクションに何かあるというのは実際に実験ベースで確かめるべきです。 またUVの２８０あたりで邪魔をしそうなのはDTTとかたぶんbMEも可能性があると思います。酸化することでUVのこの領域の吸収が上がるようなので、溶液の状態によって違う値を示したりする可能性があります。 あとは、、、アグリかけていて濁りかけているとかないでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.5529-9 - 2016/11/14 (月) 13:49:50 - かに 皆様情報ありがとうございます。 今回濃度測定したタンパク質はある生物の分泌物中に産生させたリコンビナントのものです。この分泌物はほぼタンパク質で構成されており、核酸はほとんど含まれないとされています。 抽出時にのみTritonを使用しましたが、最終産物にはほとんど残留してないかと思われます。 また、室温で測定したのでセルの結露もないはずです。 ほぼ同じ方法でタンパク質発現・精製した別のタンパク質ではBSA、吸光度ともに安定して測定できています。 タンパク質自体の性質で吸光度がバラつくことってありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.5529-8 - 2016/11/12 (土) 21:30:02 - 定量乙 紫外部吸収は非常に鋭敏だけど、A280付近に吸収をもつものはいっぱいあるので測定する試料中の成分の影響を強く受けるし、微細な不溶物などがあったりすると、値が大きく変動したりする。またpHの影響も受けるとおもう。なのでクルードな試料の正確な蛋白質濃度の定量には通常は使用しないとおもう。 クロマトとかで蛋白質の溶出パタンをモニターしたりとかには有用だけど。 また高度に精製された蛋白質標品の場合は、モル吸光係数が既知ならばA280の値から正確な濃度を計算できるので使える。BSAやIgGの標準液など作るときには役に立つ。

(無題) 削除/引用 No.5529-7 - 2016/11/08 (火) 20:42:48 - 助さん 核酸がコンタミしているのではないでしょうか？ 陽イオン交換カラムでも除去できないときがありますよ。 おおさんのおっしゃるように、スペクトルを測った方が良いです。

(無題) 削除/引用 No.5529-6 - 2016/11/08 (火) 11:49:57 - たていす 何の機械を使って測定してるのかによっても、測定値が安定しない理由になるのかもしれません。 タンパク質が氷冷されているのであれば、吸光度を測定するセルに霜が付いている可能性も有ります。BSAの方は室温で測っていれば、霜は付きません。 Nano-dropで測定するのであれば、セルを使わないので霜がつく可能性は無いでしょうね。 日本語の問題をあげつらうと嫌われることは承知の上で、「ブレる」というのは、いろんな状況を含む言葉です。困難な状況をもう少し明確に書くほうがよいだろうと思います。 それだけで、自分で解決できることかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5529-5 - 2016/11/08 (火) 10:50:00 - おお イミダゾールは２８０nm付近はそんな吸光度が高くないはずですよね、、、Ni−columnから溶出する時A280でモニターできますので。ところで一度スペクトラムを取ってみてはどうでしょうか。コファクター、DNAやRNAの結合といった場合も影響が出たりしますので。あるいはたまたま何か一緒に落ちてきたかもしれませんけど。 デタージェントは使ってませんよね。。。Triton/NP-40はかなり強い鋭いピークが２８０nmあたりにあると思います。

(無題) 削除/引用 No.5529-4 - 2016/11/07 (月) 23:18:29 - かに 情報不足でしたね。申し訳ございません。 タンパク質が何かはお応えできません。ごめんなさい。 陽イオン交換とNiアフィニティで精製後にPBSにbuffer交換しています。 イミダゾールが多少残留しているかと思いますので、吸光度に影響があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5529-3 - 2016/11/07 (月) 20:22:39 - おお 細胞のライセートなどでA280は信用できません。

あるタンパク質　ないタンパク質 削除/引用 No.5529-2 - 2016/11/07 (月) 19:25:29 - 774R どんなサンプルかが重要な情報なのに、あるタンパク質では情報不足ですね。 クルードなものなのか？　精製したものなのか？ 精製タンパクだとしたら、元の材料がなにで精製方法はなんなのか？ 要は、BCAでは安定していて、280ではブレるということだから、280に吸光を持つ不純物らしきものの量が変動してるからじゃないかというのが一つの推察なのです。どんなことをして得たタンパク質なのか分からないと、それ以上は分からんということ。

A280でのタンパク質定量のブレ 削除/引用 No.5529-1 - 2016/11/07 (月) 18:48:46 - かに はじめまして。 あるタンパク質の濃度をBCA法とA280の吸光度から測定しています。 このとき同じサンプルを使用しているのですが、BCA法では測定結果が安定するのに対して、A280ではブレがかなり大きいです。 (このときコントロールに使用したBSAではほぼ同量の測定結果が出ています) 原因としてどのようなことが考えられますでしょうか？

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