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(無題) 削除/引用 No.5515-4 - 2016/11/10 (木) 19:12:28 - ttk ダイタミ後にどうやって精製してますか？ イソプロで精製していた時は，常に特定の位置で波形に乱れがありました（目で見て修正できるレベルです）．ABIのマニュアルにあるエタノール，EDTA，酢酸ナトリウムで沈殿させて70%エタノールで塩を除く方法に変えたら乱れは消えました．精製自体は塩を使わないイソプロの方が早いのですが，現在はエタ沈を常用しています．

(無題) 削除/引用 No.5515-3 - 2016/11/05 (土) 16:09:31 - おお >始めにフォワードとリバースで配列を読んだときの結果を照らし合わせると、リバースで読んだときはGのピークはありませんでした。 ランダムに何個かリバースで読んでみてはどうでしょうか。リバースで出ないのにGを挿入する理由があるかということです。GやAがいくらか並ぶとちょっとトリッキーなところもあります。 実際にピークなど見てないし、しばらく自分で読んで解析していないので感が鈍ってしまって見ても何が言えるか私にはわからないかもしれませんが、ABI（...って今どこだっけ）とかにデーター見せながら相談してみてもいいんじゃないかな。 また、そのGが入る入らないで制限酵素認識部位ができたりなくなったりするなら、切って調べるてもあるけど。 ミトコンドリアならヘテロでマイナーなものが混じってる可能性は否定出来ないかもです。

(無題) 削除/引用 No.5515-2 - 2016/11/05 (土) 15:23:14 - mon もしかしてシークエンスしている領域(fwd primerがアニールする配列を含みrev primerがアニールする配列は含まず）がタンデムに重複していませんかね?

mtDNAの塩基配列で特定のポジションにダブルピークが出現する 削除/引用 No.5515-1 - 2016/11/01 (火) 15:46:27 - funako 初めて質問させていただきます。 mtDNAの一部領域の塩基配列を用いて、ジェノタイピングを行っています。 330 bpくらいの長さの領域です。始めに、フォワードとリバースのプライマーを用いてシーケンスを行ったところ、どちらでも全長が読めたので、残りのサンプルはすべてフォワードのみでシーケンスをしました。 波形はバックグラウンドの低い、きれいな結果を得ることができました。しかし、全てのサンプルで特定の位置（140 bpあたり）にAとGのダブルピークが出現しており、BioEditではGを認識していませんでした。当初、これを機械のミスだと考え、Aの後ろにGをマニュアルで挿入していたのですが、既にほかの方が読んでいるハプロタイプとアライメントしたところ、どのハプロタイプにもGが入っていませんでした。比較するとそのポジションのみに変異があることもあり、Gを挿入すべきではなかったのかと悩んでいます。 始めにフォワードとリバースで配列を読んだときの結果を照らし合わせると、リバースで読んだときはGのピークはありませんでした。 そこで、質問です。 １．このダブルピークのGは挿入するべきではないのでしょうか。判定するソフトなどをご存知でしたら教えていただきたいです。 ２．なぜ、mtDNAでダブルピークが生じたのでしょうか。 長文失礼しました。よろしくお願いします。

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