ご連絡が遅くなり申し訳ありません。
いただいたアドバイスに従い条件検討してみました。
まず、培養上清（OptiMEM1）にGSH-beadを加え、以下3通りの条件を試してみました。
1. 何も添加せず、GST融合タンパク質有無で比較
2. 150 mM NaCl, 1% Tx100を終濃度で加え、GST融合タンパク質有無で比較
3. 150 mM NaCl, 1% Tx100、1% BSAを終濃度で加え、GST融合タンパク質有無で比較
です。結論から言いますと、1ではGSTタンパク質有無にかかわらず非常に強いband Xが認められてしまい、前回の結果と同様でした。一方、そのようなbeadへのXの非特異的吸着は2および3で劇的に低下しました。2と3では変わりありませんでした。やはり疎水性相互作用が非特異的吸着の原因になっていたようです。ありがとうございました。
ですが、やはり2と3でもXのbeadへの非特異的吸着がゼロにならないので、本当にGSTタンパク質がXをプルダウンしているのかについては、今の所わかりません。幸い、GSTタンパク質のC末にmyc-Hisタグを付けておいたので、Nickel beadでプルダウンができますが、OptiMEM1中のアミノ酸がNickel beadに影響したりも聞きますし、若干の不安は残っています。今、Nickel beadはオーダーしているところです。
ですが、基本的にsepharoseは一緒ですし、もしかしたらNickel beadでも非特異的吸着が認められてしまうのではとの危惧もあります。イミダゾールで溶出すればいいかもしれませんが、溶出後、透析等しないとSDS-PAGEに持ち込めないですよね…
> 塩濃度、pHは効果があることもあります。
pHは検討していません。
> 蛋白をつけていないフリーのビーズかGSTだけを吸着したビーズを加えて非特異吸着を吸収してからプルダウンする手もあります。
非特異的吸着するタンパク質にXが含まれてしまっているので（どれだけ吸着しているかはわかりませんが）、プレクリアは勇気がでません。
今考えていることとして、培養上清にGSH-bead、NaCl、Tx100、GST融合タンパク質、そしてBSAを予め結合させておき（4度、数時間）、その後、培養上清を加えれば、BSAによるbeadのブロッキング効果が顕在化するのでは・・と考えていますが、うまくいくでしょうか。
tracker様、
GST融合タンパク質有無でXのbandの強さに今の所変わりはありません。
ただ、Yという他の候補タンパク質には明瞭なさが認められていますので、プルダウンはうまくいってそうです。Yはbeadには非特異的に結合していないからだと思います。 |
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